Síntesis de funcionalizados 10 nm recubierto de polímero partículas de oro para apuntar el endotelio y el suministro de medicamentos

1. preparación o adquisición de las soluciones madre (almacenar a temperatura ambiente o congelados hasta su uso) Preparar una solución madre de hidróxido de sodio (NaOH) de 1 M disolver 400 mg de NaOH en agua ultrapura de 10 mL a temperatura ambiente y mezclar bien los materiales.Nota: Agua ultrapura se define como agua sin impurezas como partículas, bacterias, nucleasas, iones o restos de materia orgánica. Un sistema de purificación se utiliza para obtener agua ultrapuro, dando por resultado su resistividad de 18,2 a mΩ·cm, indicando una baja contaminación aniónica. No se recomienda el uso de agua ultrapura embotellada comercialmente disponible. En adelante, este agua ultrapura se referirán a como el agua, a menos que se especifique lo contrario. Preparar una solución stock de NaOH de 6 M por 2,4 g de NaOH en 10 mL de agua de disolución y la solución a temperatura ambiente. Preparar una solución stock de 250 mM de ácido chloroauric (HAuCl4) disolviendo 1 g de secas HAuCl4 10,16 ml de agua. Diluir 1 mL de 250 mM HAuCl4 con 9 mL de agua para obtener la concentración de trabajo de 25 mM HAuCl4. Almacenar la solución de HAuCl4 a temperatura ambiente. Preparar un buffer de carbonato de 0.1 M pH 8.8, por disolución de bicarbonato de sodio 84 mg en 10 mL de agua y ajustar el pH a 8.8 añadiendo NaOH M 6 en el paso 1.2. Almacenar el buffer de carbonato a temperatura ambiente. Mezclar 20 mL de tetrazolio sal compuesto, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), con un agente estabilizador, METOSULFATO ethosulfate (PES) (véase Tabla de materiales). Guarde la mezcla PES/MTS en alícuotas (para un máximo de 10 ciclos de congelación y descongelación) a-20 ° C en oscuridad. 2. síntesis de los núcleos de nanopartículas de oro Preparar una solución diluida de THPC agregando 12 μl de 80% THPC en agua a 1 mL de agua en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente. Sujetar un matraz de fondo redondo de 100 mL el centro de una placa de agitación magnética. 45 mL de agua, vierta en la cubeta y agregue el agua a 300 rpm usando una barra de agitación magnética en forma de huevo pequeño. Añadir 0,5 mL de 1 M NaOH y 1 mL de solución diluida de THPC. Seguir revolviendo la mezcla de reacción vigorosamente por 5 minutos. Continuar agitando la mezcla y añadir 2 mL de solución de HAuCl4 de 25 mM. El color de la mezcla cambia de amarillo a marrón oscuro dentro de segundos, lo que indica que la formación de THPC capsulado AuNPs con una carga negativa. Revolver la mezcla por un adicional 15 min permitir la completa formación de los núcleos de oro. 3. Además de la Corona de polímero alrededor de las nanopartículas de oro Durante el período de 15 min se describe en el paso 2.3, preparar la clavija soluciones disolviendo cada uno de los siguientes en 1 mL de agua en frascos de vidrio de 4 mL: 30 mg NH2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH.Nota: Las concentraciones resultantes deben ser de 8,8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH y 3.75 M COOH-PEG-SH. Después de reducir la velocidad de agitación de la solución en el matraz de fondo redondo de 100 rpm, agregar que las soluciones de PEG a la solución de THPC capped AuNPs gota a gota. Seguir revolviendo la mezcla suavemente durante la noche, a temperatura ambiente, para garantizar la eficiente remoción de THPC y la sustitución por PEG. Para la próxima 72 h, utilice una membrana de celulosa corte de peso molecular de 12-14 kDa para dializarse la mezcla agitada contra una cubeta de 4 L de agua agitado a 60 rpm. Atar los extremos de las membranas por los clips de la diálisis y la solución de transferencia a través de la pipeta.Nota: Este proceso de diálisis con la membrana corte de 12-14 kDa sólo elimina PEG, THPC y otros reactivos químicos, por la difusión a lo largo de un gradiente de concentración. Para mantener el alto gradiente de la concentración y promover la difusión continua, cambie el agua cada 2 h para las primeras 6 h y cada 6-12 h para los restantes 66 h.Nota: El propósito de este programa de cambio de agua debe adaptarse a la rápida difusión que ocurre desde el principio debido a la concentración inicialmente alta dentro de la muestra. El proceso de diálisis había descrito hojas la solución de nanopartículas semi purificada, ya que las nanopartículas, precipitados, agregados y otras impurezas de gran tamaño no pueden pasar a través de los poros de la membrana corte de 12-14 kDa. Filtrar la solución parcialmente purificada de la nanopartícula en un tubo cónico de 50mL usando un filtro de jeringa de 0,2 μm para eliminar los precipitados restantes, agregados y otras impurezas de gran tamaño. Coloque el tubo cónico en un congelador de-80 ° C y deje que la solución purificada de PEGylated AuNP (PEG-AuNP) congelar por cerca de 5 horas. Utilice una secador de congelación para liofilizar el PEG-AuNP purificado. Almacenar el PEG-AuNP seco, purificado a 4 ° C hasta su uso. 4. conjugar fluoróforos con éster N-hydroxysuccinimide (NHS) en el NH2 grupos en el PEG-AuNP Sujetar un matraz de fondo redondo de 50 mL el centro de una placa de agitación magnética. Llene el frasco con 18 mL de agua y revolver el agua a 100 rpm con una barra de agitación magnética en forma de huevo. Pesar 2 mg del PEG-AuNP liofilizado en un tubo cónico de 4 mL, utilizando una escala de trabajo de alta precisión. Use una pistola antiestática para eliminar la carga estática y aferramiento de la AuNP PEG polvo a la superficie del tubo. Añadir 2 mL de agua al tubo. Verter lo 2 mL de solución de PEG-AuNP al matraz de fondo redondo para la reconstitución de un total de 20 mL de agua. Seguir revolviendo la mezcla a 100 rpm con una barra de agitación magnética en forma de huevo. Añadir 1 mL de 0.1 M, pH 8,8 carbonato tampón a los 20 mL del AuNP reconstituido contenido en el matraz de fondo redondo. Continuar revolviendo. Añadir 5 μl de éster de NHS fluorescente de 10 mg/mL en dimetilsulfóxido.Nota: Puede utilizarse cualquier colorante fluorescente en este proceso. Remover la clavija fluorescente durante la noche. Mantener a temperatura ambiente y cubierta en papel de aluminio. Para la próxima 72 h, quitar exceso fluoróforos utilizando el protocolo descrito en el paso 3.3. Brevemente, dializan la mezcla agitada con una cubeta de 4 L de agua y una membrana de celulosa corte de peso molecular de 12-14 kDa. Cambie el agua cada 2 h durante las primeras 6 h y cada 6-12 h para los restantes 66 h. Obtener 1 mL de la solución de PEG-AuNP fluorescente purificada, que se utilizará para la caracterización que se describe a continuación en la sección 5. Congelar y liofilizar la solución restante para obtener nanopartículas fluorescentes en polvo para el almacenamiento a 4 ° C, como se describe en pasos 3.5-3.7. Utilice un filtro de jeringa de 0,2 μm para esterilizar y eliminar cualquier potencial precipita una vez reconstituida para aplicaciones de la cultura de célula. 5. Caracterización de nanopartículas de oro pegilado fluorescente Utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM) para visualizar la base de nanopartículas de oro y cuantificar el tamaño Coloque 10 μl de la solución de PEG-AuNP fluorescente purificada en una cuadrícula TEM de mallas recubiertas de carbón. Después de 5 min, use un pedazo de papel de filtro para mecha cuidadosamente lejos exceso de líquido desde el borde de la rejilla TEM hasta una película que contiene el fluorescente que PEG AuNPs se quede atrás. Ve el PEG-AuNPs fluorescente 80 kV y a un aumento de 50.000-150.000. Tomar fotos digitales.Nota: Sólo la base del oro será visible porque el PEG no es electrón denso en el TEM. Mediante un software de medición, establecer la escala de medición en correlación a la barra de escala. Calcular los diámetros de aproximadamente 20 corazones de oro y luego determinar el diámetro promedio base oro.Nota: El sistema de proyección de imagen de TEM coloca automáticamente una barra de escala en las imágenes digitales. Medición de tamaño de nanopartícula hidrodinámico con dispersión ligera dinámica (DLS) Transferencia de 1 mg de liofilizado AuNPs THPC revestido en un tubo de microcentrífuga utilizando el enfoque descrito en el paso 4.2. Transferencia de 1 mg de liofilizado PEG-AuNP en un tubo separado. Añadir 1 mL de agua a cada tubo y transferir cada solución AuNP a un 1 mL de plástico transparente. Colocar una cubeta en un instrumento DLS y medir diámetros hidrodinámicos esféricos utilizando el software de analizador de partículas integrado en el sistema DLS. Trazar los diámetros hidrodinámicos medidos utilizando un formato de histograma.Nota: El histograma será grupo de nanopartículas de tamaño. El grupo más grande de las nanopartículas clarificará el diámetro que mejor describa el tamaño de las AuNPs sintetizados en el presente Protocolo. Confirmación de fluorescencia fluorométricoNota: La misma muestra y cubeta de paso 5.2 pueden utilizarse para medir la señal fluorescente. Sacar la cubeta de la DLS e inserte en un spectrofluorometer. Conjunto de señales de la longitud de onda de excitación a 633 nm y leer la fluorescencia emitida a lo largo de una longitud de onda de 650-800 nm. Confirmar que el pico es aproximadamente 665 nm, que se corresponde con el pico de emisión para el NHS.Nota: Ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión según el fluoróforo utilizado en el proceso. MTS11 para evaluar la biocompatibilidad del análisis En un cultivo estériles para tejidos claros de 96 pocillos fondo trata de la placa, Pipetee 100 μl de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM; suplementado con 10% fetal bovino suero y 1% de penicilina/estreptomicina) y 3.2 x 103 células en cada pozo.Nota: En este estudio, se utilizan células endoteliales de la almohadilla de grasa de rata. Un total de 21 pozos se utilizan para permitir 3 repeticiones para cada una de las 7 concentraciones diferentes nanopartículas (ver paso 5.4.3 para concentraciones específicas de interés). Permitir a las células crecer a confluencia en humedad y 5% CO2 controlada incubadoras en 37 ° C11. Preparar los tubos de microcentrífuga individuales, cada una con 300 μL de DMEM con nanopartículas de diferentes concentraciones. Este estudio requiere 7 diferentes tubos de DMEM con las siguientes concentraciones de PEG-AuNP: 0 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL y 1.000 μg/mL. Aspire el DMEM del tubo. Llenar los pozos por triplicado con 100 μl de medio DMEM con 0, 10, 50, 100, 250, 500 o 1.000 μg/mL del AuNP. Permitir que las células y nanopartículas de co incubar durante un período determinado de tiempo, aquí durante 16 horas. Cerca del final de la incubación, descongelar la mezcla MTS/PES de paso 1.5. Después de la incubación, aspirar el DMEM y las nanopartículas suspendidas, vagamente conectadas de los pozos. Añada 100 μl de DMEM fresco junto con 20 μl de solución de MTS/PES para obtener 1:5 MTS/PES relación DMEM según protocolo del fabricante. Incubar las células con PES/MTS a 37 ° C por 2 h.Nota: Este tiempo de incubación de 2 h está determinada por la actividad metabólica de las células endoteliales y puede aumentarse hasta 4 h para otros tipos de células. Dentro del período de 2 h, el MTS es metabolizado por las células endoteliales a formazan coloreado que se mezcla con el DMEM. Biocompatibilidad de los PEG-AuNP y la probabilidad de la viabilidad celular se demostrará con precipitado coloreado. Toxicidad de la PEG-AuNP y la posibilidad de que las células mueren se mostrará de color menos intenso. Realizar el análisis colorimétrico de cada pozo mediante la lectura de absorbancia a 492 nm con un lector de placas compatibles. Para cada concentración de nanopartículas, calcular la absorbancia promedio de los valores de absorbancia por triplicado. Divida la absorbancia promedio por el valor obtenido del promedio de la absorbancia en los pozos que contienen nanopartículas μg/mL 0.Nota: Estos pozos que no contienen AuNPs sirven como controles para el cálculo de porcentaje viabilidad celular en respuesta al tratamiento de nanopartículas en otros pozos. Evaluación de la microscopia confocal de la fluorescencia de la absorción de nanopartículas en las células endoteliales adherentes con glicocálix intacto o disfuncional11 Semillas 1.0 x 104 células/cm2 rata grasa células endoteliales sobre cubreobjetos de vidrio de 12 mm estéril del cojín y alimentar las células con DMEM suplementado con 10% fetal bovino suero y 1% de penicilina/estreptomicina. Permitir a las células crecer en plena confluencia en humedad y CO2 controlada incubadoras a 37 ° C, durante aproximadamente 3 días. Añadir tratamientos para modificar el Glicocálix, si corresponde. Por ejemplo, 2 h tratamiento de las células endoteliales cultivadas con 2.5 x 10-6 IU heparinase enzima III degrada el glicocálix por unirse específicamente su componente sulfato de heparán.Nota: Se puede modelar glicocálix saludable por crecimiento de las células endoteliales como se describe en el paso 5.5.1 sin la adición de enzimas de degradación. Con el glicocálix endotelial deja intacto o vuelto disfuncional, incubar las células endoteliales con fluorescente AuNPs en 550 μg/mL durante 16 horas o en otro momento deseado. Lave suavemente las células con 2 mL de albúmina sérica bovina de 37 ° C de 1% en tampón fosfato salino (PBS, que contiene 100 mg/L calcio y magnesio de 100 mg/L). Sumergir las células en 2 mL de paraformaldehído al 2% y 0.1% de glutaraldehído en PBS y permitir a las células reparar por 30 min a temperatura ambiente. Retirar la solución de fijación de aldehído y lavan las células con PBS de temperatura para los tres ciclos de 5 minutos. Antes de la aplicación del anticuerpo primario, exponer a las células endoteliales al suero de cabra 2% en PBS por 30 min a temperatura ambiente para bloquear sitios de Unión inespecífica. Las células deben estar completamente cubiertas por la solución de bloqueo. Incube las células endoteliales durante la noche con 1% anti-heparán sulfato primaria del anticuerpo en el suero de cabra 2% en PBS en 4 ° C para el componente de sulfato de heparán de la glicocálix de la etiqueta. Asegúrese de que las células fijas son completamente en contacto con la solución de anticuerpo. Al día siguiente, lavar el anticuerpo con temperatura PBS para los tres ciclos de 10 minutos. Incube las células endoteliales con 1:1,000 dilución del anticuerpo secundario fluorescente apropiado durante 30 min a temperatura ambiente, en el oscuro o cubierto con papel de aluminio. Lavar el anticuerpo secundario con temperatura PBS para los tres ciclos de 10 minutos. Coloque el cubreobjetos en portaobjetos de microscopio usando un medio de montaje anti-fade que contiene 4′, 6-diamidino-2-phenylindole, diclorhidrato (DAPI) para la tinción de núcleos. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Imagen de la célula endotelial immunostained fluorescente muestras con microscopía confocal, utilizando canales azul, verdes y rojos ahora para visualizar los núcleos, heparán sulfato glicocálix y las nanopartículas, respectivamente.