粒子の合成機能 10 nm ポリマー コーティング金対象化、血管内皮細胞とドラッグデリバリー

1. 準備や原液の調達 (常温保存するまたは使用するまで冷凍) 1 M 水酸化ナトリウム (NaOH) のストック溶液を準備するには、400 mg 室温で 10 mL の純水に水酸化ナトリウムを溶解し、材料をよく混合します。注: 超純水は、微粒子、細菌、核酸分解酵素、イオン、微量有機物などの不純物のない水として定義されます。浄化システムは、純水、その抵抗率最大 18.2 mΩ·cm、低い陰イオン性汚染を示す結果を取得する使用されます。市販のボトル入りの純水の使用は推奨されません。今後は、この純水に届けられる水として特に指定しない限り。 6 M NaOH 原液を水 10 mL に水酸化ナトリウムの 2.4 g を溶解することにより準備し、室温でソリューションを格納します。 乾燥 HAuCl4 10.16 mL の水に 1 g を溶解して塩化金酸 (HAuCl4) の 250 mM の原液を準備します。250 mm HAuCl4 25 mM HAuCl4の作業濃度を取得する 9 mL の水を 1 mL を希釈します。室温で HAuCl4ソリューションを格納します。 10 mL の水で炭酸水素ナトリウム 84 mg を溶解し、ステップ 1.2 から 6 M NaOH を加えることによって 8.8 pH を調整する ph 8.8, 0.1 M 炭酸バッファーを準備します。常温の炭酸バッファーを格納します。 ミックス 20 mL テトラゾリウムの化合物、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium の塩 (MTS)、安定化剤、ethosulfate フェナジン (PES) (材料の表を参照してください)。暗闇の中での-20 ° C で (最大 10 freeze-thaw 周期) のための因数で MTS/PES 混合物を格納します。 金ナノ粒子のコアの合成 80% の 12 μ L を追加することで薄めた THPC を準備 THPC を室温で遠心管中の水の 1 mL の水の中。 電磁攪拌プレートの中央に 100 mL の丸底フラスコを保護します。45 mL の水をフラスコに注ぎ、小さな卵型電磁攪拌棒を使用して 300 rpm で水をかき混ぜます。0.5 mL 1 メートル naoh 水溶液の希釈 THPC 溶液 1 mL を追加します。5 分は積極的に反応混合物を攪拌し続けます。 混合物を攪拌を続行し、25 mM HAuCl4ソリューションの 2 mL を追加します。混合物の色は、数秒以内に、THPC の形成は、負の電荷と金ナノ粒子を上限を示すダークブラウンに黄色から変更されます。金コアの完全な形成を許可する追加の 15 分のための混合物をかき混ぜなさい。 金ナノ粒子を高分子コロナの追記 2.3 の手順に従って 15 分期間中にペグ ソリューションによって準備 4 mL ガラスバイアルに 1 mL の水で、次のそれぞれの溶解: 30 mg NH2-ペグ-SH。7.5 mg m-ペグ-SH。7.5 mg COOH ペグ SH。注: 結果として得られる濃度は 8.8 M NH2をする必要があります-ペグ-SH、3.75 M m-ペグ-SH と 3.75 M COOH-ペグ-SH。 100 rpm を丸底フラスコの溶液の攪拌速度を減らし、THPC のソリューションに PEG 溶液滴下金ナノ粒子の上限を追加します。THPC の効率的な除去やペグが交換できるように、室温で一晩ゆっくり混合物を攪拌し続けます。 次の 72 h 60 rpm で攪拌水を 4 L バケットに対する撹拌した混合物を dialyze に 12-14 kDa の分子量カットオフ セルロース膜を使用します。透析クリップによって膜の両端を結ぶし、ピペットによるソリューションを転送します。注: この透析プロセス 12-14 kDa カットオフ膜を削除だけ未反応ペグ、THPC、および他の化学反応によって濃度勾配に沿う拡散です。 高濃度勾配を維持し、継続的な拡散を促進するため、最初の 6 h の h ごとの 2 と残り 66 時間ごとの 6-12 h 水を変更します。注: この水変更スケジュールの目的は、サンプル内で最初に高い濃度のために、早い段階で発生する急速な普及に対応するためです。透析プロセス上記葉半精製、ナノ粒子溶液ナノ粒子、沈殿物、集計、および他の大きいサイズの不純物は、12-14 kDa カットオフ膜の細孔を通過できませんので。 半精製ナノ粒子溶液を 0.2 μ m のシリンジ フィルターを使用して残りの沈殿物、集計、および他の大きいサイズの不純物を削除する、50 mL の円錐管にフィルターします。 -80 ° C のフリーザーに円錐形の管を配置でき、約 5 時間の凍結する精製ペグインターフェロン AuNP (ペグ AuNP) ソリューション。 精製ペグ AuNP を凍乾するのに凍結乾燥機を使用します。 使用するまで 4 ° c の乾燥、精製のペグ AuNP を格納します。 4. NH2グループに N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルを用いた PEG AuNP Fluorophores の活用 電磁攪拌プレートの中心に 50 mL の丸底フラスコを保護します。18 mL の水でフラスコを満たすし、卵型電磁攪拌バーを使用して 100 rpm で水をかき混ぜます。 高精度卓上スケールを使用して 4 つの mL の円錐管に 2 mg 凍結乾燥ペグ AuNP の重量を量る。静電気とチューブ表面にペグ AuNP パウダーの付着を除去するために帯電防止銃を使用します。チューブに 2 mL の水を追加します。2 mL ペグ AuNP ソリューションを 20 mL の水の合計で再建の丸底フラスコに注ぐ。卵型電磁攪拌バーを使用して 100 rpm で混合物を攪拌し続けます。 炭酸塩の pH 8.8 20 mL の丸底フラスコに含まれる再構成された AuNP のバッファー、0.1 M の 1 mL を追加します。攪拌を続けます。 ジメチルスルホキシド中 10 mg/mL 蛍光 NHS エステルの 5 μ L を追加します。注: 任意の蛍光染料は、このプロセスで使用することができます。蛍光のペグを一晩撹拌します。部屋の温度でそれを維持し、箔で覆われています。 次の 72 h 手順 3.3 で説明したプロトコルを使用して余分な蛍光物質を削除します。簡単に言えば、水と 12-14 kDa の分子量カットオフ セルロース膜の 4 L バケットを使用して攪拌混合物を dialyze します。最初の 6 h 毎 2 h と残り 66 時間毎 6-12 h 水を変更します。 特性次のセクション 5 で説明するために、精製の蛍光ペグ AuNP 溶液 1 mL を取得します。フリーズし、3.5 3.7 の手順で説明されているように 4 ° C で保存用の粉末状の形で蛍光ナノ粒子を取得する残りの溶液を凍結乾燥します。 0.2 μ m シリンジ フィルターを使用して、殺菌、細胞培養用再構成一度任意の潜在的な沈殿物を削除します。 5. 蛍光 peg 化金ナノ粒子のキャラクタリゼーション 金ナノ粒子のコアを視覚化し、サイズを数値化する透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用 カーボン コート メッシュ TEM グリッドに精製された蛍光ペグ AuNP 液の 10 μ L をドロップします。 5 分後に慎重にまで PEG 結果を残した蛍光を含むフィルム TEM グリッドの端から離れて余分な液体を放出するのにろ紙の部分を使用します。 80 で蛍光ペグ金ナノ粒子を表示 kV、50,000-150, 000 の倍率。デジタル写真を撮る。注: ペグは電子温度に密ではないため金コアのみが表示されます。 測定ソフトウェアを使用すると、スケール バーの相関関係の計測スケールを設定します。約 20 の金コアの直径を計算し、平均金コア径を決定します。注: 電子顕微鏡イメージング システムは自動的にデジタル画像のスケール バーを配置します。 動的光散乱法 (DLS) を使用して流体力学的ナノ粒子サイズの測定 手順 4.2 で説明したアプローチを使用して微量遠心チューブに凍結乾燥 THPC 被覆金ナノ粒子の 1 mg を転送します。別の管内凍結乾燥ペグ AuNP 1 mg を転送します。各管に 1 mL の水を追加し、各 AuNP ソリューションを 1 mL の透明なプラスチックに転送します。 DLS 音色にキュベットを置き、DL システムに組み込まれている粒子アナライザー ソフトウェアを使用して球状の流体力学的直径を測定します。 ヒストグラム形式を使用して測定流体力学的直径をプロットします。メモ: ヒストグラムは、サイズによってナノ粒子をグループ化されます。ナノ粒子の最大のグループはこのプロトコルで合成された金ナノ粒子のサイズに最も近い直径を明らかにします。 蛍光蛍光確認注: 同じサンプルと手順 5.2 からのキュベットは、蛍光信号を測定する使用できます。 DL からのキュベットを削除、挿入、蛍光します。650-800 nm の波長範囲に沿って信号の励起波長 633 nm と読んで放出される蛍光のセット。 ピークが約 665 であることを確認 nm は、NHS の放出ピークに関連します。注: によると、プロセスで使用される蛍光体励起と放射の波長を調整します。 MTS は、生体適合性を評価するために11を試金します。 治療 96 ウェル透明な底無菌培養プレート、ダルベッコ変更イーグル培地の 100 μ L をピペット (DMEM; 10% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを補完) と各ウェルに 10 の3セル × 3.2。注: この研究では、ラットの脂肪パッドの内皮細胞が使用されます。ウェルズ 21 の合計は、(興味の特定濃度 5.4.3 手順を参照してください) 7 の異なるナノ粒子濃度のそれぞれ 3 複製のために使用されます。 37 ° C11時 CO2制御インキュベーターの湿度と 5% の confluency に成長する細胞を許可します。 それぞれ様々 な濃度の微粒子を含む DMEM の 300 μ L を含む個々 の遠心管を準備します。今回次のペグ AuNP 濃度 DMEM の 7 の異なるチューブが必要です: 0 μ g/mL、10 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL、250 μ g/mL、500 μ g/mL、1,000 μ g/mL。 チューブから DMEM を吸い出しなさい。0、10、50、100、250、500、または AuNP の 1,000 μ g/mL を含む DMEM メディアの 100 μ L で 3 通の井戸を埋めます。 細胞と共同のインキュベート時間 16 h のためにここの前もって決定された長さにナノ粒子を許可します。 潜伏期間の終わり、近くステップ 1.5 から MTS/PES の混合物を解凍します。 インキュベーション後、井戸から中断、緩く接続されているナノ粒子と、DMEM を吸引します。製造元のプロトコルに従って DMEM 比 1:5 の MTS/PES を取得する MTS/PES 溶液 20 μ L と一緒に新鮮な DMEM の 100 μ L を追加します。2 h の 37 ° C で MTS/ペスとセルを孵化させなさい。注: この 2 h、インキュベーション時間は内皮細胞の代謝活動によって決定され、他の細胞型の 4 h までに増やすことができます。2 h 以内では、MTS は、DMEM にミックス色の塩に内皮細胞によって代謝されます。ペグ AuNP の生体適合性と細胞生存率の可能性より色の塩で実証されます。ペグ AuNP と細胞が死んでいるチャンスの毒性は、あまり強烈な色になります。 492 吸光度を読み取ることによって各ウェルの比色分析を行うと互換性のあるプレート リーダーの nm。 それぞれのナノ粒子濃度の帳票の吸光度の値から平均吸光度を計算します。平均吸光度を 0 μ g/mL ナノ粒子を含む井戸の吸光度の平均から取得した値で除算します。注: 結果が含まれていないこれらの井戸は、他井戸の投与ナノ粒子治療への反応の割合の細胞生存率を計算するためのコントロールとして機能します。 そのまま、または機能不全の糖衣11血管内皮細胞の接着におけるナノ粒子の吸収量の蛍光共焦点顕微鏡による評価 種子 1.0 × 104セル/cm2ラット脂肪滅菌 12 mm ガラス カバーガラス上血管内皮細胞をパッドし、10% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを DMEM に細胞をフィードします。約 3 日間の湿度と 37 ° C で CO2制御インキュベーターで完全 confluency に成長する細胞を許可します。 該当する場合、糖衣を修正する治療を追加します。たとえば、2.5 x 10-6 IU ヘパリナーゼ III 酵素による培養内皮細胞の 2 h 治療特にヘパラン硫酸、そのコンポーネントを切断し、糖衣が低下します。注: 手順 5.5.1 分解酵素の添加なしで内皮細胞を成長することにより健全な糖衣をモデリングできます。 そのまままたはレンダリング機能不全の内皮の糖衣と 16 時間 550 μ G/ml または他の目的の時間に蛍光金ナノ粒子と内皮細胞をインキュベートします。 2 ml 37 ° C 1% ウシ血清アルブミン リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 100 mg/L のカルシウムとマグネシウム 100 mg/L を含む) の細胞を優しく洗います。2% パラホルムアルデヒドの 2 mL のセル、pbs は、0.1% グルタルアルデヒドが水没し、室温で 30 分間を修正するセルを許可します。 アルデヒド固定ソリューションを削除し、3 つの 5 分サイクルの室温 PBS のセルを洗ってください。 一次抗体のアプリケーションの前に PBS で非特異的結合部位をブロックするために室温で 30 分間の 2% ヤギ血清に内皮細胞を公開します。セルは、ブロッキング液で完全にカバーする必要があります。 血管内皮細胞の一晩 1% 尖端のヘパラン硫酸コンポーネントのラベルに 4 ° C で PBS で 2% ヤギ血清中抗ヘパラン硫酸一次抗体を孵化させなさい。固定セルを完全に抗体溶液と接触していることを確認します。 次の日を 3 つの 10 分サイクルの室温 PBS で抗体を洗います。 縮尺暗いまたはアルミ箔で覆われて、室温で 30 分間の適切な蛍光抗体の希釈で内皮細胞を孵化させなさい。 3 つの 10 分サイクルの PBS の室温の二次抗体を洗い流します。 耐フェード取付の媒体含んでいる 4′, 6-diamidino-2-phenylindole、核染色 (DAPI) 二塩酸塩を使用して顕微鏡スライド上に coverslip をマウントします。マニキュアを使用してカバーガラスのエッジをシールします。 蛍光 immunostained 内皮細胞の画像は、共焦点顕微鏡、それぞれ核、ヘパラン硫酸糖衣、ナノ粒子を視覚化する青、緑と遠赤のチャンネルを使用してサンプルします。