用于内皮靶向和药物传递的功能化10纳米高分子涂层金粒子的合成

1. 库存解决方案的准备或采购 (储存在室温或冻结使用之前) 在室温下, 在10毫升超纯水中溶解400毫克氢氧化钠, 制备出1米氢氧化钠 (氢氧化钠) 溶液, 并将物料混合均匀。注: 超纯水是指无杂质的水, 如微粒、细菌、核酸、离子或有机物的痕迹。纯化系统用于获得超纯水, 其电阻率可达 18.2 mΩ·cm, 表明低阴离子污染。不推荐使用商用瓶装超纯水。从今以后, 这种超纯水将被称为水, 除非另有规定。 在10毫升的水中溶解2.4 克氢氧化钠, 并在室温下储存溶液, 以制备一个6M 的氢氧化钠溶液。 在10.16 毫升的水中溶解1克干 HAuCl4 , 制备金酸 (HAuCl4) 的250毫米库存溶液。稀释1毫升的250毫米 HAuCl4与9毫升水, 以获得工作浓度 25 mm HAuCl4。在室温下存储 HAuCl4解决方案。 在 ph 值8.8 处制备0.1 米碳酸盐缓冲液, 在10毫升水中溶解84毫克碳酸氢钠, 并在步骤8.8 中加入6米氢氧化钠, 调整 ph 值至1.2。在室温下储存碳酸盐缓冲液。 混合20毫升的唑化合物, 3-(45-dimethylthiazol-2-基)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-磺)-2 h-唑盐 (MTS), 具有稳定剂, 嗪基 (PES) (请参阅材料表)。将 MTS/PES 混合物储存在等分 (最多10冻融循环) 在-20 ° c 的黑暗中。 2. 金纳米粒子芯的合成 准备一个稀释的 THPC 溶液, 在室温下, 在离心管中加入12µL 80% THPC 水到1毫升的水中。 在磁搅拌板的中心上固定一个100毫升的圆形底烧瓶。将45毫升的水倒入烧瓶中, 用一个小的蛋形磁力搅拌棒搅动 300 rpm 的水。加入0.5 毫升1米氢氧化钠和1毫升稀释 THPC 溶液。继续积极搅拌反应混合物5分钟。 继续搅拌混合物, 并添加2毫升的 25 mM HAuCl4解决方案。混合物的颜色会在几秒钟内从黄色变成深褐色, 这表明 THPC 盖 AuNPs 的形成是负电荷。搅拌的混合物为一个额外的15分钟, 以允许完全形成的黄金核心。 3. 在金纳米粒子周围添加聚合物电晕 在步骤2.3 中描述的15分钟内, 通过在4毫升的玻璃瓶中溶解下面的1毫升水中的每一个, 准备 peg 解决方案:30 毫克 NH2-peg-SH;7.5 毫克 m-PEG-SH;7.5 毫克羧基-SH。注: 所产生的浓度应为8.8 米 NH2-peg-sh, 3.75 m m-sh, 和3.75 米羧基-sh。 在将圆底烧瓶中的溶液搅拌速度降低到 100 rpm 后, 在 THPC 帽 AuNPs 滴的溶液中加入 PEG 溶液。继续在室温下轻轻搅拌, 以确保高效去除 THPC 和用 PEG 代替。 在接下来的72小时, 使用 12-14 kDa 分子量截止纤维素膜透析搅拌混合物对4升桶水搅拌 60 rpm。通过透析夹将膜的两端系在一起, 然后通过吸管转移溶液。注: 这一透析过程与 12-14 kDa 截止膜只去除未 PEG, THPC, 和其他化学反应物, 通过扩散沿浓度梯度。 为了保持高浓度梯度和促进连续扩散, 改变水每 2 h 为前 6 h 和每 6-12 h 为剩余的 66 h。注: 本水变化计划的目的是为了适应早期发生的快速扩散, 因为样品中最初的高浓度。上述的透析过程使纳米粒子溶液 semi-purified, 因为纳米颗粒、沉淀物、聚合体和其他大尺寸的杂质不能通过 12-14 kDa 截止膜的孔隙。 将 semi-purified 纳米微粒溶液过滤成50毫升的锥形管, 使用0.2 µm 注射器过滤器除去剩余的沉淀物、骨料和其他大尺寸杂质。 将锥形管置于-80 ° c 的冷冻库中, 并允许纯化的乙二醇 AuNP (PEG-AuNP) 溶液冻结约5小时。 使用冷冻干燥机 lyophilize 纯化的 PEG-AuNP。 将干燥、纯化的 PEG AuNP 在4° c 贮存, 直至使用。 4. 共轭荧光使用 n-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯到 NH2组上的 PEG-AuNP 在磁搅拌板的中心上固定一个50毫升的圆形底烧瓶。用18毫升的水灌满烧瓶, 用一个蛋形的磁力搅拌棒将水搅拌100分钟。 重2毫克的冻干 PEG AuNP 在4毫升锥管, 使用高精度台式规模。使用防静电枪, 以消除静电电荷和附着的 PEG AuNP 粉的管面。把2毫升的水加到管子里。将2毫升 PEG-AuNP 溶液倒入圆底烧瓶中, 以便在总共20毫升的水中进行进一步的重组。继续搅拌的混合物在 100 rpm 使用一个鸡蛋形的磁力搅拌棒。 添加1毫升0.1 米, pH 8.8 碳酸盐缓冲到20毫升重组 AuNP 包含在圆底烧瓶。继续搅拌。 在二甲基亚砜中添加5µL 10 毫克/毫升荧光琥珀酰亚胺酯。注: 任何荧光染料都可以在这个过程中使用。在一夜之间搅动荧光钉。保持室温, 用铝箔盖住。 在接下来的72小时中, 使用步骤3.3 中描述的协议删除多余的荧光。简要地, 透析搅拌混合使用4升水桶和 12-14 kDa 分子量截止纤维素膜。改变的水每2小时的前6小时和每6-12 小时的剩余66小时。 获得1毫升的纯化荧光 PEG-AuNP 溶液, 将用于在下文5节描述的特性。如步骤 3.5-3.7 所述, 冻结并 lyophilize 余下的溶液以粉状形式获得荧光纳米粒子以贮存在4° c。 使用0.2 µm 注射器过滤器, 以消毒和消除任何潜在的沉淀物一旦重组为细胞培养应用。 5. 荧光乙二醇金纳米粒子的表征 利用透射电子显微镜 (TEM) 对金纳米粒子的核心进行可视化, 并对其大小进行量化 将纯化的荧光 PEG-AuNP 溶液滴10µL 在碳涂层网格上。 5分钟后, 用一张滤纸仔细地将多余的液体从 TEM 网格的边缘吸走, 直到一部含有荧光钉 AuNPs 的胶片被留下。 查看荧光 PEG-AuNPs 在 80 kV 和放大5000万。拍摄数码照片。注: 只有金芯才可见, 因为在 TEM 上, PEG 不是电子致密的。 使用测量软件, 设置与刻度条相关的测量刻度。计算直径约20金芯, 然后确定平均金芯直径。注: TEM 成像系统自动在数字图像上放置刻度线。 动态光散射 (dl) 法测量水动力纳米粒尺寸 使用步骤4.2 中描述的方法将1毫克冻干 THPC 涂层 AuNPs 到离心管中。将1毫克冻干的 PEG AuNP 在单独的试管中。在每根管子上加1毫升的水, 并将每个 AuNP 溶液转换为1毫升的透明塑料。 将试管放入 dl 仪器中, 并使用内置在 dl 系统中的粒子分析器软件测量球形水动力直径。 使用直方图格式绘制测量的水动力直径。注: 直方图将按大小对纳米粒子进行分组。最大的一组纳米粒子将澄清的直径, 最好的描述 AuNPs 的大小的合成在这个协议。 荧光萤光确认注: 同一样品和试管从步骤5.2 可以用来测量荧光信号。 从 dl 中删除试管并插入到光中。将激发波长设置为 633 nm, 并沿着 650-800 nm 波长范围读取发射的荧光信号。 确认峰值大约为 665 nm, 这与 NHS 的排放峰值有关。注意: 根据过程中使用的荧光调整激发和发射波长。 MTS 检测11评估生物相容性 在一个96井清底无菌组织培养处理板, 吸管100µL Dulbecco 氏改良鹰的培养基 (DMEM; 补充10% 胎牛血清和1% 青霉素/链霉素) 和 3.2 x 103细胞到每个井。注: 本研究采用大鼠脂肪垫内皮细胞。总共21口井用于允许7种不同的纳米颗粒浓度的3个复制 (参见步骤5.4.3 的特定浓度的兴趣)。 允许细胞生长到70-100 在湿度和 5% CO2控制孵化器在37° c11。 准备单独的离心管, 每一个都含有300µL 的 DMEM 和不同浓度的纳米颗粒。这项研究需要7不同的 DMEM 与以下 PEG-AuNP 浓度: 0 µg/毫升, 10 µg/毫升, 50 µg/毫升, 100 µg/毫升, 250 µg/毫升, 500 µg/毫升, 和1000µg/毫升。 从试管中抽出 DMEM。用100µL 的 DMEM 介质填入井中, 其中含有0、10、50、100、250、500或1000µg/毫升 AuNP。 允许细胞和纳米粒子在预定的时间长度 co-incubate, 这里为16小时。 在潜伏期接近尾声, 解冻的 MTS/PES 混合物从步骤1.5。 在孵化后, 吸入 DMEM 和悬浮的, 松散附着的纳米颗粒从井。添加100µL 的新鲜 DMEM 连同20µL 的 mts/pes 解决方案获得 1:5 mts/pes 的 DMEM 比根据制造商的协议。用 MTS/PES 在37° c 下孵育2小时的细胞。注: 这 2 h 潜伏期由内皮细胞的新陈代谢活动决定, 并且可以增加到 4 h 为其他细胞类型。在2小时内, 该 MTS 被内皮细胞代谢成有色甲, 与 DMEM 混合。AuNP 的生物相容性和细胞活力的可能性将被证明有更多的有色甲。PEG-AuNP 的毒性和细胞死亡的几率会显示出不那么强烈的颜色。 使用兼容的平板阅读器读取 492 nm 的吸光度, 对每个井进行比色分析。 对于每个纳米粒子的浓度, 计算三个吸光度值的平均吸收量。将平均吸光度除以在含0µg/毫升纳米颗粒的油井中的吸光度平均值。注: 这些不含 AuNPs 的水井是用于计算在其他油井中施用纳米颗粒处理后的细胞存活率的控制措施。 荧光共聚焦显微镜对黏附或功能失调的内皮细胞摄取纳米颗粒的糖11 种子 1.0 x 104细胞/cm2大鼠脂肪垫内皮细胞到无菌12毫米玻璃片和饲料细胞与 DMEM 补充10% 胎牛血清和1% 青霉素/链霉素。允许细胞生长到完全70-100 在湿度和 CO2控制孵化器在37° c, 大约3天。 添加治疗, 以修改糖, 如果适用。例如, 2 h 治疗的培养内皮细胞与 2.5 x 10-6酶 III 酶降解糖通过专门裂解其素硫酸盐成分。注意: 健康的糖可以通过生长5.5.1 中所描述的内皮细胞来模拟, 而不需要添加降解酶。 内皮糖保持完整或功能失调, 孵育的内皮细胞与荧光 AuNPs 在550µg/毫升16小时或其他需要的时间。 用2毫升37° c 1% 牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲盐水 (PBS; 含100毫克/升钙和100毫克/升镁) 轻轻冲洗细胞。在 PBS 中浸没2毫升2% 甲醛和0.1% 戊二醛的细胞, 并允许细胞在室温下固定30分钟。 取出醛固定液, 用室温 PBS 清洗细胞三5分钟。 在初级抗体应用前, 在 PBS 中, 在室温下30分钟将内皮细胞暴露在2% 山羊血清中, 以阻断非特异性结合位点。单元格必须完全由阻塞解决方案覆盖。 在4° c 的 PBS 中, 用 1% anti-heparan 硫酸根原抗体在2% 山羊血清中孵育内皮细胞, 以标记糖的素硫酸盐成分。确保固定细胞与抗体溶液完全接触。 第二天, 用室温 PBS 清洗抗体三10分钟。 孵育内皮细胞与 1:1, 000 稀释适当的荧光二次抗体在室温下, 在黑暗中或用铝箔覆盖的30分钟。 用室温 PBS 清洗二次抗体三10分钟的周期。 将片安装在显微镜上, 使用含有4的防、6-diamidino-2-吲、二盐酸盐 (DAPI) 进行细胞核染色的安装介质。用指甲油封住片的边缘。 图像荧光 immunostained 内皮细胞样品与共聚焦显微镜, 使用蓝色, 绿色和远红色通道, 以可视化的细胞核, 素硫酸糖, 和纳米粒子, 分别。