整形外科術後の高次脳機能障害と組織再生を研究するマウス モデル

横骨切り術をピンと適切な縫合の安定挿入無菌条件下で慎重に行った後、マウスは跛行や感染症、手術後左下肢の出血の兆候を示した。サフラニン O 後レントゲン解析と強度を使用して査定された整形外科治療 (図 2) を染色します。骨幹部骨折脛骨のレントゲン写真には、若いマウスより老齢マウスの破壊角質の破壊角質より組織沈着が示されます。破壊角質は脱灰され、組織学的解析のための準備でパラフィンに埋め込まれました。サフラニン O 染色、強度解析を用いて組織沈着を定量化します。破壊角質若いマウスの骨老齢マウスから破壊角質より小さい線維組織を含まれています。 脛骨骨折は、全身および中央炎症6,7,11,15,16を誘導します。確かに、末梢レベルのプロ炎症性サイトカインと危険性関連分子パターン (DAMPs) は、マウスとヒトの7,17,18両方整形外科後急速に昇格されます。これは、細胞、体液、神経経路7,15,19,20を含むいくつかのシグナル伝達メカニズムを介して脳のミクログリア細胞の活性化に貢献します。 21。次の手術、内皮機能障害、血液脳関門のオープニング、周辺マクロファージ浸潤は野生型と Ccr2 急性海馬 neuroinflammation に貢献RFP/+ Cx3cr1GFP/+アダルト マウス15,19、人間せん妄と術後認知機能障害15,19,22のようにその後記憶障害に関連付けられているとします。IBA 1 免疫染色 (図 3) によって検出された、このアミロイドの応答、ミクログリアの形態の大幅な変更と高齢動物で悪化します。 ここで説明する脛骨骨折モデルを使用して、またわかった一過性障害海馬ニューロン新生、海馬歯状回20doublecortin (DCX) 免疫染色の減少によって証明されるよう.長期増強 (LTP)、メモリー機能のためのサロゲートの電気生理学的測定は、術後神経可塑性の時間依存型破壊を明らかに11。手術後のマウスは海馬依存性の記憶関数、たとえば恐怖条件付け行動評価 (図 4) を使用して、障害を表示します。恐怖条件付けマウスが商工会議所に配置し、有害な刺激 (すなわち、フット ショック) 続いて聴覚手がかりにさらされています。脛骨の手術後 3 日間はあらゆる聴覚や嫌悪刺激せず今回エアコン室でマウスをテストし、凍結挙動 (詳細なプロトコルを参照してください23) のメモリのインデックスとして記録されます。 高齢者は、記憶低下の重要な危険因子です。まだ、私たちの年齢として組織の修復と再生の能力も減少するこれらのメカニズムの理解が不十分なまま。したがって、我々 は記載 (ヤング/古い動物をペアリング) heterochronic パラビオーゼを実行するプロトコルを使用、破壊 (詳細なパラビオーゼ プロトコルを参照してください24) の高齢のマウスの中に癒しを評価しました。Parabiotic ペア間血共有だった確認し、等しい12のあることが判明します。以前組合と若々しい循環強化骨修復への暴露は、骨沈着を増加し、線維化 (図 5)12を減少します。骨再生のこの若返り内因性オステオカルシン陽性骨芽細胞 (図 5、茶色のセル) の独立が発生しましたが、むしろ若い parabiont (図 5、青いセル) から移行 CD45 陽性細胞に頼って.CD45 陽性造血細胞がよりアクティブになるそれらを誘発する高齢者の骨芽細胞に信号が若々しく、健康的なニッチを分泌することが示唆されました。 図 1: パラビオーゼと脛骨骨折手術の模式図.(A) パラビオーゼと脛骨骨折 (プロトコル 1 a) や脛骨骨折だけで (プロトコル 1 b) を実行するためのタイムラインです。(B) バイノーラルビートまたは heterochronic parabiotic のペアで 20 ヶ月齢マウスの脛骨がフラクチャされた (マウスの右の右脚がフラクチャされている X と示された)。グリーン マウスは eGFP マウスを描写しながら、灰色のマウスは野生型マウスを描いています。(C) 髄内固定と骨幹骨折脛骨骨折モデルの模式図。後肢の 3次元再構成と脛骨の固定の補助ビデオ 1も参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 脛骨骨折は、老いも若きもマウス モデル内で治癒します。若いまたは古いマウスの脛骨を骨折した、破壊角質調査の 21 日のポスト傷害。(A) 放射線イメージングおよび組織学的染色 (サフラニン-O) 破壊角質 21 日ポスト破壊を評価する使用されました。染色は、青と赤でプロテオグリカン (軟骨内) で膠原線維組織を示しています。破線は、破壊のカルスのおおよその位置を示しています。(B) 強度は、骨、軟骨、および線維化組織破壊カルス 21 日ポスト破壊内堆積量を評価するために使用されました。平均 ± 95% 信頼区間データを表現する、* P < 0.05 で、統計的に有意な (一方通行 ANOVA、Dunnett のテスト)、スケール バーが 2 mm を表し、顕微鏡、1.25 倍の目的を使用して画像を得た。n = 各サンプルの 9。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: 手術による海馬における年齢依存性ミクログリア活性化。脛骨骨折手術は高齢マウス (20 ヶ) 4 ヶ C57BL6/J マウスと比較された大きい海馬 neuroinflammation を誘導します。脳セクション ミクログリア マーカー IBA 1 染色より積極的な手術後 24 h ・ グループのセルと外科の形態学的変化を示しています。100 倍の倍率で epifluorescent 顕微鏡で画像が得られた;。スケール バーを表す 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: 脛骨骨折手術後の神経新生、長期増強と記憶機能の障害です。(A) DCX、神経、定量的なマーカーが手術後 24 h で海馬歯状回に削減します。10 x の倍率で共焦点レーザー スキャン顕微鏡目的で画像が得られました。バー μ m 10 を表します。 コントロールまたはマウス 24 h から海馬スライスで (B) を電気生理学手術後スケールします。長期増強 (LTP) 高頻度刺激 (HFS) によって誘導され、記録 1 時間以上定期的に満たされた細胞外記録ピペットを使用して CA1 地層結腸寄生虫から記録されたフィールド興奮性シナプス後電位 (fEPSPs)人工髄液。手術後 24 時間は、ltp は制御マウスに比べて激減します。データは平均 ± s.e.m. n で表される = 3、* p < 0.05 1 ウェイ分散。(C) 海馬依存メモリ機能 (トレースを使用して凍結の % として定義されている恐怖) はマウスのコントロールと比較しての手術と麻酔だけに暴露された動物後損なわれます。データは平均 ± s.e.m. n で表される 9-10 = * p < 0.05 1 ウェイ分散。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: パラビオーゼ手術は骨折の治癒、血共有、およびドナー細胞の生着の若返りにつながる。バイノーラルビートと heterochronic パラビオーゼの組み合わせが確立され、各ペアの高齢マウスは骨折し骨の治癒を評価しました。(A) 破壊放射線イメージングを使用して角質を調べた。破線は、破壊のカルスのおおよその位置を示しています。(B) 生着 eGFP 陽性細胞の骨髄内で確認されました。破壊カルスの (C) を免疫組織化学は、eGFP+ドナー細胞 (青) とオステオカルシン+骨芽細胞 (茶色)、parabiont からを識別するために使用されました。スケール バーは、50 μ m を表し、40 × 対物を使用して画像を得た。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 補助ビデオ 1: 三次元の後肢と脛骨を固定します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。