דגם העכבר של כירורגיה אורתופדית ללמוד לאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי ו התחדשות רקמות
Summary
פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של כירורגיה אורתופדית, שבו נעשה שימוש כדי לחקור מנגנונים של neuroinflammation לאחר הניתוח, שינויים התנהגותיים, וכאשר בשילוב עם parabiosis, ללמוד התחדשות רקמות במהלך ההזדקנות.
Abstract
הניתוח משמש בדרך כלל כדי לשפר ולתחזק את איכות החיים. למרבה הצער, בחולים פגיעים כגון הקשישים, סיבוכים עשוי להתרחש, לצמצם באופן משמעותי את התוצאה. ואכן, אחרי שגרתי אורתופדיה לתיקון שבר, כ 50% מהחולים קשישים סובלים סיבוכים נוירולוגיים כמו הזיות. בנוסף, היכולת לרפא ולחדש רקמות אחרי ניתוח פוחתת עם הגיל, יכולים להשפיע על איכות תיקון שבר ושילוב אפילו osseous של שתלים. לפיכך, הבנה טובה יותר של מנגנוני לנהוג שינויים תלויי-גיל אלה יכול לספק מטרות אסטרטגיות כדי למזער את הסיכון של סיבוכים כאלה ולמטב את התוצאות. כאן, אנחנו מציגים מודל העכבר הרלוונטית קלינית של שבר הטיביאלי. שינויים אלו עכברים לאחר הניתוח לחקות חלק ליקויים קוגניטיביים נצפו בדרך כלל לאחר ניתוח אורתופדי שגרתית אצל בני אדם. בקצרה, מבוצע חתך האיבר הינד נכון בתנאים בקפדנות אספטי. השרירים הם לבטל את שיוך, סיכה 0.38 מ מ נירוסטה מוכנס לתוך הפסגה העליונה של עצם השוקה, בתוך התעלה אורתופדיים. Osteotomy ואז מבוצעת, הפצע יהודק. השתמשנו מודל זה לחקור את ההשפעות של טראומה כירורגי על neuroinflammation לאחר הניתוח ושינויים התנהגותיים. על-ידי החלת מודל שבר זה בשילוב עם parabiosis, מודל כירורגי שבו שני עברים הם anastomosed, למדנו תאים וגורמים המופרש זה מערכתית להצעיר את התחדשות הרקמות ותפקוד איברים לאחר פציעה. לפי פרוטוקול צעד אחר צעד שלנו, מודלים אלה שניתן להפיק עם דיוק גבוה, ניתן להתאים לחקור משעולים ביולוגיים רבים שמשתנים כירורגית טראומה מינית.
Introduction
הניתוח הפך את מערכת הבריאות רפואי ללא הרף תורמת רתימת הטכנולוגיה, בטיחות משופרת, ומתוחזק איכות החיים. למרבה הצער, הניתוח גורם גם תגובות pathophysiologic זה יכול להוביל לסיבוכים לאחר הניתוח כולל זיהומים בפצע, ליקויים נוירולוגיים, אפילו התמותה, בפרט בחולים קשישים1,2. כירורגיה אורתופדית מתבצע באופן שגרתי, במיוחד אצל מבוגרים יותר, כדי לשפר את איכות החיים ולתקן פציעות נפוצות העצם. עם זאת, עד 50% מהחולים אורתופדיה 65 שנה, מבוגר יותר ניסיון ליקויים נוירולוגיים כגון הזיות. זה בעקביות בקורלציה עם פרוגנוזה גרועה, קרי, 5-fold סיכון מוגבר לתמותה ב 6 חודשים, ירידה תפקודית מתמיד, גדל זמן לכל לחולה, הגדלת אורך השהות בבית החולים, שיעור גבוה יותר של מיקום בית אבות סיעודי 3 , 4 , 5. כמה גורמי סיכון, לרבות גילו המתקדם, זוהו, אבל מעט מאוד ידוע על המנגנון האחראי על ליקויים נוירולוגיים לאחר הניתוח.
מאז שברים נפוצים מאוד אצל הקשישים, הקמנו דגם העכבר של שבר הטיביאלי כדי לקבוע את ההשפעה של טראומה היקפיים על התאוששות לאחר הניתוח, כולל neuroinflammation והמוח בריאות (תפקוד קוגניטיבי)6, 7. מודל זה, תיארו את התופעה על ידי הארי. et al. 8, מורכב לשדי הצמדה ותשבור הטיביאלי תחת הרדמה כללית, שיכוך כאבים ובכך מחקה את העור פציעה, טראומה שריר, ועצם תיקון מזוהה עם שברים עצם נפוצים ותיקון בבני אדם. לאחר הליך זה, עכברים להדגים שינויים בסמני דלקת דומה לשינויים שנצפתה בני9,10, כמו גם הפעלת microglial בהיפוקמפוס, אשר מזוהה עם גירעונות בזיכרון הצהרתי, בהיפוקמפוס והנוירולוגיה הפלסטית6,7,11. קודם לכן שילבנו מודל זה שבר עם parabiosis. Parabiosis הוא מודל כירורגי שבו שני עברים הם anastomosed ובכך ושיתוף של מערכת הדם. מודל זה סיפקה פריצת דרך בהבנה של השפעות הרגולציה של מחזורי תאים וגורמים ההורמונאלית על תפקוד האיבר בהקשר של הגיל ומחלות12,13,14. באמצעות גישה זו גילינו לאחרונה מערכתית גורמים הקשורים עם שבר תלויי-גיל12ריפוי.
כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול שמשלב המודל שבר tibial parabiosis ללמוד מנגנונים תלויי-גיל עצמות-כדי-מוח, רלבנטיות רפואה רגנרטיבית ו- neuroimmunology. פרוטוקול 1A מתאר את הליך parabiosis, ואת פרוטוקול 1B פרטי ההליך שבר הטיביאלי (איור 1 א’). אלה ניתן לבצע באופן עצמאי או בשילוב, בהתאם לאופי החקירה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שברים הן בעיה קלינית נפוצה, להישאר גורם התחלואה, במיוחד בקרב האוכלוסייה בכיר בצמיחה. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דגם העכבר של שבר הטיביאלי לחקור מנגנונים האחראים neuroinflammation לאחר הניתוח, פגיעה קוגניטיבית. מודל זה יכול להיות משולב עם ניתוח parabiosis ללמוד אינטראקציות נוירו-החיסון, התחדשות רקמות ותהליכים איתות אחרים. הבנת המנגנונים האלה יספקו מטרות אסטרטגיות כדי למזער את הסיכונים סיבוכים לאחר הניתוח ולמטב את התוצאות.
מספר מודלים אורטופדי פותחו ללמוד תיקון עצם מכרסמים25. אנחנו אימצה, לשנות הליך זה שבר הטיביאלי, תיארו את התופעה על ידי הארי. et al. 8, ללמוד על ההשפעות של ניתוח אורתופדי על תפקוד המוח. גם השתמשנו מודל שבר זה בשילוב עם מודל parabiosis שלנו לחקור גורמים שאחראים על עצם ריפוי והתחדשות רקמות תלויי-גיל. כאשר מבוצעת בהרדמה כללית נדיפים, הליך זה שבר הטיביאלי דורש רק כ 15 דקות לכל חיה, התוצאה אפס התמותה מינימלי (תלוי בגילו של העכבר על susceptibilities גנטית כבסיס), וזה recapitulates נפוצות עלבונות המשויך לונג-שבר וטראומה כירורגית אורתופדית. לפיכך, המודל הזה הוא אידיאלי עבור חוקרים מסלולים ביולוגיים וביצוע הערכות האורך. עם זאת, זה קריטי זה osteotomy, הצמדה לשחזור, ויש את הנזק ברקמה הרכה עקבית. נזק לרקמות רכות יכול להיות מאופנן, לדוגמה על-ידי בנוכחות אחר קרום העצם, התכווצות השרירים שמסביב לבצע את הניתוח יותר טראומטי. מודלים של שבר הטראומטית הנגרמת על ידי שאינו קבוע טראומה קהה או כיפוף השלשה לא יספק עקביות או דיוק כזה. הליכים אלה לעיתים קרובות לגרום re-פציעה, מה שמוביל לתגובה דלקתית ממושכת. לעומת זאת, מודלים של שבר מעורבים קיבוע נוקשה יש דלקת מתונה יותר, אשר לא לסכם באופן מלא את הנזק המשויך אורתופדיה26,27.
דגמים אחרים באמצעות הצמדה סגסוגת טיטניום פותחו כדי שכיחיםהחלפת האנושי מקרוב מחקים, עשוי להיות רלוונטי יותר לחקור את חוסר היציבות של תותבת, osteolysis, וסיבוכים הקשורים תותבת עכברים28,29 . מודלים לקדוח חורים כמו זה המוצג כאן, מספקים מייצב נאותה, עכברים יכול להיבדק בפרדיגמות התנהגותי ללא חסרונות משמעותיים זה יכול לבלבל משימות כגון פחד מיזוג או פתח שדה ומכניקה/חרדה בדיקות6 ,7,11,15,19,20. עם זאת, מומים המסתובבת יכול להתרחש אם הקיבעון לא נעולה כראוי. בדגמים מסוימים להשתמש fixator חיצוני, אשר מספק מייצב מעולה אבל הוא מאתגר ליישם בשוקה העכבר, למרות שזה יכול להיות מיושם בהצלחה הירך של העכבר27.
ליקויים קוגניטיביים, כולל הזיות לאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי, סיבוכים נפוצים לאחר ניתוח אורתופדי לתיקון שבר, בפרט בחולים קשישים ומקומט30. מודל זה העכבר הרלוונטית קלינית של ניתוח שבר הטיביאלי מדגים שכי לאחר הניתוח ציטוקין מערכתית שחרור6,7,17, ליקויי מחסום הדם – מוח פונקציה15,19 , שונה microglial מורפולוגיה16,22, לתרום ליקוי זיכרון ואני עשוי לייצג תכונות קריטיות של סיבוכים נוירולוגיים לאחר הניתוח אצל חולים רבים אחרי ניתוח אורטופדי. חשוב לציין כי ניתוחים אחרים השתמשו לדגמן לאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי בעכברים. אלה כוללים בטן31,32,33 ו ניתוח כלי דם34 , וכן שטחיים לטראומה35,36. הטכניקה parabiosis ישימה לכל של מודלים אלה, אשר חולקים הקצה דומים, כולל דלקת, הפעלת גליה חסרונות התנהגותיים, זה עשוי להיות מתווכת על ידי מנגנונים משותפים.
מחקרים הכוללים parabiosis גילו תפקידים הרומן במחזור גורמים יכולים להשפיע על תפקוד קוגניטיבי, neuroinflammation, והתחדשות רקמות ב חיות בגיל37,38,39,40 ,41,42. אנחנו הראו ש-parabiosis הזה יכול להיות משולב בהצלחה עם שבר הטיביאלי המודל המתואר כאן לחקור מסלולים משובי וללמוד מנגנונים מעורבים גורמים נישא בדם כי ההשפעה ריפוי, שבר תיקון12. כאן, אנחנו הפגינו יכולת תיקון שבר של חיה גיל יכול יתרענן כאשר החיה בגילאי הוא anastomosed על חיים צעירים. ההיפוך של גיל היה נעוץ את engraftment של תאים hematopoietic באתר שבר. מעניין, התחדשות כזה יכול גם להיות מושגת באמצעות השתלת של מח העצם הצעיר לתוך עכברים בגיל העמידה. בהקשר זה, השתלת מח עצם יכול להיחשב בגישה אלטרנטיבית ישירים ופשוטים יותר כדי parabiosis. עם זאת, parabiosis הוא מודל עמידים יותר על חקירת הפונקציה של מחזורי תאים וגורמים. אנו מצפים כי שילוב של parabiosis ומודלים אורתופדיה ישחק תפקיד חשוב לענות על שאלות קריטיות perioperative טיפול וביולוגיה הזדקנות.
לסיכום, אנחנו מציגים את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דגם העכבר של שבר הטיביאלי לחקור מנגנונים האחראים neuroinflammation לאחר הניתוח, פגיעה קוגניטיבית לאחר ניתוחים אורתופדיים. מודל זה יכול להיות משולב עם הליך parabiosis ללמוד אינטראקציות נוירו-החיסון, התחדשות רקמות, מסלולים אחרים. הגדרת מנגנונים אלה תספק מטרות אסטרטגיות כדי למזער את הסיכונים סיבוכים לאחר הניתוח ולמטב את התוצאות.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים קטי גייג ‘, BS (החוג להרדמה, המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק, דורהאם, NC) לקבלת סיוע העריכה. NT מאשר תמיכה של מענק חדשנות החלום של הדוכס להרדמה ו- NIH/ניאה R01 AG057525-01.
Materials
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
| Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
| 10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
| MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
| Shaver | Wahl | 9854L | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades – #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
| Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1×2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
| Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
| 22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
| Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
| Suture | Look | 1079B | |
| C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
| eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |
References
- Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
- Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
- Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. Delirium in elderly people. Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).
- Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
- Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
- Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
- Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
- Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
- Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211 (2016).
- Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
- Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
- Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131 (2015).
- Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90 (2011).
- Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
- Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
- Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
- Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
- Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
- Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
- Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
- Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229 (2017).
- Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace fear conditioning in mice. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
- Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. 38, S3-S6 (2007).
- Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
- Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
- AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
- Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268 (2016).
- Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
- Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346 (2015).
- Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
- Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
- Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
- Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
- Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).
