نموذج ماوس لجراحة العظام لدراسة الخلل المعرفي بعد العملية الجراحية وتجديد الأنسجة
Summary
ويصف هذا البروتوكول نموذج ماوس لجراحة العظام التي استخدمت لدراسة آليات neuroinflammation بعد العملية الجراحية، والتغيرات السلوكية، وعندما جنبا إلى جنب مع بارابيوسيس، لدراسة تجديد الأنسجة أثناء الشيخوخة.
Abstract
جراحة يستخدم عادة لتحسين والحفاظ على نوعية الحياة. ولسوء الحظ، في المرضى الذين يعانون ضعفا مثل كبار السن، مضاعفات قد تحدث وتقلل إلى حد كبير من النتائج. وفي الواقع، بعد جراحة العظام الروتيني لإصلاح كسر، ما يصل إلى 50% مرضى المسنين يعانون من المضاعفات العصبية مثل هذيان. أيضا، القدرة على شفاء وتجديد الأنسجة بعد عملية جراحية يتناقص مع التقدم في العمر، ويمكن أن يؤثر على نوعية إصلاح الكسر والتكامل العظمى حتى يزرع. وهكذا، يمكن أن توفر فهم أفضل للآليات التي تدفع هذه التغيرات تعتمد على العمر أهدافا استراتيجية للتقليل من خطر الإصابة بهذه المضاعفات وتحسين النتائج. هنا، نحن نقدم نموذجا ماوس ذات صلة سريرياً لكسر قصبي. التغييرات بعد العملية الجراحية في هذه الفئران تقليد بعض الإعاقات الإدراكية لوحظ عموما بعد جراحة العظام الروتيني في البشر. باختصار، يتم إجراء شق في أطرافهم هند الحق تحت ظروف معقمة تماما. يتم فصل العضلات، ويتم إدراج pin فولاذ المقاوم للصدأ 0.38 ملم في كريست العلوي من الساق، داخل القناة إينتراميدولاري. ثم يتم تنفيذ العظم، ويتم تدبيس الجرح. وقد استخدمنا هذا النموذج للتحقيق في آثار الصدمات الجراحية على نيوروينفلاميشن بعد العملية الجراحية والتغييرات السلوكية. بتطبيق هذا النموذج الكسر في تركيبة مع بارابيوسيس، نموذج العمليات جراحية التي يتم أناستوموسيد 2 الفئران، وقد درسنا الخلايا ويفرز عوامل تجديد عناصره تجديد الجهاز وظيفة والأنسجة بعد الإصابة. عن طريق اتباع لدينا البروتوكول خطوة بخطوة، هذه النماذج يمكن استنساخها بالدقة العالية، ويمكن تكييفها لاستجواب العديد من الممرات البيولوجية التي يتم استبدالها بواسطة الصدمات الجراحية.
Introduction
جراحة حولت نظام الرعاية الصحية الطبية وتساهم بشكل مستمر للتكنولوجيا المتطورة، وتحسين السلامة، والحفاظ على نوعية الحياة. لسوء الحظ، يدفع جراحة أيضا الردود باثوفيسيولوجيك التي يمكن أن تؤدي إلى مضاعفات ما بعد الجراحة بما في ذلك عدوى الجرح واعتلالات الجهاز العصبي وحتى الوفيات، وبخاصة في المرضى كبار السن1،2. يتم إجراء جراحة العظام بشكل روتيني، لا سيما في البالغين الأكبر سنا، لتحسين نوعية الحياة وإصلاح إصابات العظام شيوعاً. ومع ذلك، تصل إلى 50 في المائة مرضى جراحة العظام الذين هم 65 عاماً وأقدم تجربة العاهات العصبية مثل الهذيان بعد الجراحة. وهذا يرتبط بسوء التشخيص، أي، 5 إضعاف زيادة خطر للوفيات في 6 أشهر، التدني الوظيفي المستمر، ازداد باطراد التمريض الوقت لكل المرضى، وزيادة طول الإقامة في المستشفى، وارتفاع معدلات التوظيف التمريض المنزلي 3 , 4 , 5-وقد حددت بعض عوامل الخطر، بما في ذلك سن متقدمة، ولكن يعرف الكثير عن الآليات المسؤولة عن اعتلالات الجهاز العصبي بعد الجراحة.
منذ الكسور شائعة جداً لدى كبار السن، وقد أنشأنا نموذج ماوس لكسر قصبي لتحديد أثر الصدمة الطرفية على التعافي بعد العملية الجراحية، بما في ذلك نيوروينفلاميشن والدماغ الصحة (الوظائف المعرفية)6، 7-هذا النموذج، الذي وصف في الأصل قبل هاري et al. 8، يتكون من تعلق إينتراميدولاري وكسر قصبي تحت التخدير العام والتسكين، وهكذا يحاكي إصابة الجلد والعضلات الصدمة النفسية، والعظام إصلاح المقترنة مع كسور العظام الطويلة المشتركة وإصلاح البشر. وبعد هذا الإجراء، الفئران تبين التغييرات في علامات التهابات مماثلة للتغيرات التي لوحظت في البشر9،10، فضلا عن تفعيل ميكروجليال في قرن آمون، التي ترتبط بالعجز في الذاكرة التصريحية و أعصاب هيبوكامبال6،،من711. جمعنا سابقا بين هذا النموذج الكسر مع بارابيوسيس. بارابيوسيس هو نموذج العمليات جراحية التي يتم أناستوموسيد الفئران 2، وهكذا مشاركة نظام الدورة الدموية. وقدم هذا النموذج انفراجة في فهم الآثار التنظيمية لتعميم خلايا وعوامل خلطيه في وظيفة الجهاز في سياق العمر والمرض12،،من1314. باستخدام هذا النهج اكتشفنا مؤخرا العوامل المنهجية المرتبطة بكسر السن-تعتمد على شفاء12.
وهنا، نقدم بروتوكول الذي يجمع بين الطراز كسر قصبي مع بارابيوسيس لدراسة آليات تعتمد على سن عظم إلى الدماغ، والتي لها صلة بالطب التجديدي، ونيورويمونولوجي. 1A بروتوكول وصف الإجراء بارابيوسيس، وبروتوكول 1B تفاصيل الإجراء كسر قصبي (الشكل 1A). وهذه يمكن أن يؤديها بشكل مستقل أو في تركيبة، تبعاً لطبيعة عملية الاستجواب.
Protocol
Representative Results
Discussion
كسور مشكلة سريرية مشتركة، ولا تزال سببا رئيسيا للإصابة بالأمراض، لا سيما في سرعة نمو السكان كبار. وهنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لنموذج ماوس لكسر قصبي لدراسة الآليات المسؤولة عن نيوروينفلاميشن بعد العملية الجراحية، وضعف الإدراك. يمكن أن يقترن هذا النموذج إلى جراحة بارابيوسيس دراسة التفاعلات المناعية العصبية، وتجديد الأنسجة، وعمليات إرسال الإشارات الأخرى. وستوفر فهم هذه الآليات أهدافا استراتيجية للتقليل من المخاطر التي يتعرض لها مضاعفات بعد العملية الجراحية وتحسين النتائج.
تم تطوير عدة نماذج العظام لدراسة إصلاح العظام في القوارض25. اعتمدنا وتعديل هذا الإجراء كسر الدانية، وصف في الأصل قبل هاري et al. 8، لدراسة آثار جراحة العظام على وظيفة المخ. نحن أيضا استخدمت هذا النموذج الكسر في تركيبة مع نموذجنا بارابيوسيس للتحقيق في العوامل المسؤولة عن التئام العظام وتجديد الأنسجة تعتمد على العمر. عند إجراء عملية تحت التخدير العام متقلبة، هذا الإجراء كسر قصبي يتطلب فقط حوالي 15 دقيقة لكل الحيوانات، النتائج في صفر إلى وفيات أقل (تبعاً لعمر الماوس وحساسيات الوراثية الكامنة)، ويلخص المشتركة الشتائم المرتبطة بكسر العظام الطويلة والعظام من الصدمات الجراحية. وهكذا، هذا النموذج مثالي لاستجواب الممرات البيولوجية وإجراء تقييمات الطولية. ومع ذلك، من الأهمية بمكان أن العظم وتعلق استنساخه، وأن الضرر الذي يلحق الأنسجة اللينة ويتسق. فعلى سبيل المثال يمكن التضمين تلف الأنسجة اللينة بتجريد في السمحاق ومعسر العضلات المحيطة بها لجعل الجراحة الرضية أكثر. لن يقدم نماذج كسر الصدمة الناجمة عن صدمات حادة غير ثابت أو الانحناء ثلاث نقاط مثل هذا الاتساق أو دقتها. وكثيراً ما تسفر هذه الإجراءات إعادة-الإصابة، مما يؤدي إلى الاستجابة الالتهابية المطول. على العكس من ذلك، نماذج كسور التي تشمل تثبيت جامدة لها التهاب أكثر اعتدالا، التي لا الخص تماما الأضرار المرتبطة بجراحه العظام26،27.
نماذج أخرى باستخدام سبائك التيتانيوم تعلق وضعت لتقويم مفاصل الإنسان تحاكي عن كثب، وقد يكون أكثر صلة باستجواب الأطراف الاصطناعية نتيجة عدم الاستقرار، وعظام النهايات، والمضاعفات المرتبطة ببدلة في الفئران28،29 . نماذج حفر حفرة واحدة المعروضة هنا، توفير الاستقرار الكافي، ويمكن اختبارها الفئران في النماذج السلوكية دون العجز الكبيرة التي يمكن الخلط بين مهام مثل الخوف تكييف أو فتح مجال الحركة/القلق اختبار6 ،،من711،15،،من1920. ومع ذلك، يمكن أن تحدث تشوهات التناوب إذا لم يتم تأمين التثبيت بشكل صحيح. بعض نماذج استخدام التبعي خارجي، الذي يوفر الاستقرار متفوقة ولكنه يمثل تحديا لتنفيذ في الساق ماوس، على الرغم من أنه يمكن تنفيذها بنجاح في عظم الفخذ ماوس27.
العاهات المعرفية، بما في ذلك الهذيان والخلل المعرفي بعد العملية الجراحية، هي المضاعفات المشتركة بعد جراحة العظام لإصلاح كسور، وبخاصة في المرضى كبار السن والضعفاء30. يوضح هذا النموذج الماوس ذات الصلة سريرياً جراحة كسر الدانية أن سيتوكين النظامية بعد العملية الجراحية الإصدار6،7،17، أعاق حاجز الدم في الدماغ الدالة15،19 ، وغيرت microglial مورفولوجيا16،22وتسهم في ضعف الذاكرة، وقد تمثل الميزات الهامة من المضاعفات العصبية بعد العملية الجراحية وينظر في العديد من المرضى بعد جراحة العظام. من المهم ملاحظة أن الإجراءات الجراحية الأخرى قد استخدمت لنموذج الخلل المعرفي بعد العملية الجراحية في الفئران. وتشمل هذه البطن31،،من3233 وجراحة الأوعية الدموية34 ، فضلا عن الصدمات سطحية35،36. تقنية بارابيوسيس ينطبق على كل من هذه النماذج، التي تشترك في النهاية مماثلة، بما في ذلك الالتهاب والتنشيط الدبقية والعجز السلوكية، التي قد تكون بوساطة من الآليات المشتركة.
وقد كشفت الدراسات التي تتضمن بارابيوسيس أدوار جديدة لتعميم العوامل التي يمكن أن تؤثر على الوظائف المعرفية، ونيوروينفلاميشن، وتجديد الأنسجة في الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين37،،من3839،40 ،،من4142. وقد أظهرنا أن بارابيوسيس يمكن أن يكون بنجاح جنبا إلى جنب مع نموذج كسر قصبي الموصوفة هنا لاستجواب مسارات التجدد ودراسة الآليات التي تنطوي على عوامل المنقولة بالدم أن تأثير الشفاء وكسر إصلاح12. وهنا، أثبتنا أن قدرة إصلاح الكسر الحيوان الذين تتراوح أعمارهم بين يمكن أن تجدد شبابها عند الحيوان العمر هو anastomosed لحيوان شباب. هذا عكس العمر متأصل في انجرافتمينت الخلايا المكونة للدم في موقع الكسر. من المثير للاهتمام، يمكن أيضا تحقيق مثل هذا التجديد عن طريق زرع نخاع العظام الشباب في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين. وفي هذا الصدد، يمكن اعتبار زرع نخاع العظام نهج بديلة أكثر مباشرة وأكثر بساطة بارابيوسيس. ومع ذلك، بارابيوسيس نموذجا أكثر قوة للتحقيق مهمة تعميم خلايا وعوامل. ونحن نتوقع أن الجمع بين بارابيوسيس ونماذج جراحة العظام سوف تلعب دوراً هاما في الإجابة على الأسئلة الحرجة في الرعاية المحيطة بالجراحة والبيولوجيا الشيخوخة.
باختصار، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لنموذج ماوس لكسر قصبي لدراسة الآليات المسؤولة عن نيوروينفلاميشن بعد العملية الجراحية، وضعف الإدراك بعد الإجراءات الجراحية العظمية. هذا النموذج يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع إجراء بارابيوسيس لدراسة التفاعلات المناعية العصبية، وتجديد الأنسجة، ومسارات أخرى. وسيوفر تحديد هذه الآليات أهدافا استراتيجية للتقليل من المخاطر التي يتعرض لها مضاعفات بعد العملية الجراحية وتحسين النتائج.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر كاثي غيج، بكالوريوس (قسم التخدير، المركز الطبي بجامعة ديوك، دورهام، كارولاينا الشمالية) للمساعدة التحريرية. وتسلم NT الدعم من “منحة الإبداع” حلم من التخدير ديوك، والمعاهد الوطنية للصحة/نيا R01 AG057525-01.
Materials
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
| Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
| 10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
| MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
| Shaver | Wahl | 9854L | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades – #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
| Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1×2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
| Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
| 22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
| Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
| Suture | Look | 1079B | |
| C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
| eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |
References
- Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
- Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
- Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. Delirium in elderly people. Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).
- Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
- Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
- Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
- Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
- Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
- Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211 (2016).
- Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
- Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
- Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131 (2015).
- Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90 (2011).
- Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
- Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
- Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
- Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
- Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
- Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
- Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
- Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229 (2017).
- Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace fear conditioning in mice. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
- Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. 38, S3-S6 (2007).
- Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
- Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
- AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
- Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268 (2016).
- Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
- Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346 (2015).
- Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
- Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
- Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
- Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
- Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).
