Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales
Summary
Este protocolo describe métodos para registrar la respuesta auditiva del médula oblonga de crías de rata postnatal. Para examinar el desarrollo funcional de las células de pelo externas, el procedimiento experimental de la abrazadera del remiendo de célula entera en aisladas células de pelo externas se describe paso a paso.
Abstract
La célula de pelo externa es uno de los dos tipos de células de pelo sensoriales en la cóclea mamífera. Modificar la longitud de su celular con el receptor potencial para amplificar la vibración débil de señal de bajo nivel sonoro. La morfología y propiedades electrofisiológicas de las células ciliadas externas (CCE) se convierten en edad postnatal. La maduración de la célula de pelo externa puede contribuir al desarrollo del sistema auditivo. Sin embargo, el proceso de desarrollo de la CCE no se estudia bien. Esto es en parte debido a la dificultad para medir su función mediante un método electrofisiológico. Con el fin de desarrollar un método simple para solucionar el problema anterior, aquí se describe un protocolo paso a paso para estudiar la función del CCE en agudo disociado cóclea de ratas postnatales. Con este método, podemos evaluar la respuesta coclear al estímulo de tono puro y examinar el nivel de expresión y la función de la proteína motora prestin en CCE. Este método también puede utilizarse para investigar las células ciliadas internas (CCI).
Introduction
Dos funciones distintas de las células de pelo sensoriales cocleares son esenciales para mamíferos de audición: transducción de mechanoelectric (MET) y electromotilidad1,2. Por MET canales en el paquete de cabello, ciliadas (CCI) y CCE convertir la vibración sonora en cambios de potencial de membrana, así como las señales eléctricas de las neuronas del ganglio espiral inervada. OHCs cambian su longitud de la célula con el potencial de membrana y amplifican la vibración del sonido de bajo nivel. Esta actividad denominada electromotilidad es derivada por la proteína motora prestin situado en la pared lateral del CCE3.
En muchas especies como roedores, la función auditiva es inmadura en la época postnatal temprana4,5. Ningún potencial de acción en respuesta a señales de sonido podría ser detectado en la corteza auditiva antes de la audiencia Inicio6,7. Desarrollo de la morfología y función de la cóclea ha sido ampliamente estudiadas en el ratón, jerbo y rata4,5,8. La mecanotransducción y electromotilidad de las células de pelo también se desarrollan en la primera época de vida5.
Para evaluar la sensibilidad auditiva de ratas a diferentes edades postnatales, hemos desarrollado un método de respuesta auditiva del médula oblonga (ABR) en crías de rata. Abrazadera del remiendo de celulares es una tecnología ideal para investigar la CCE electrophysiologically. Sin embargo, en comparación con la abrazadera del remiendo en las neuronas y otras células epiteliales, la baja tasa de células completas sellado limitada la investigación de electromotilidad de CCE aislada.
Aquí describimos un procedimiento para investigar la CCE morfológicamente y electrophysiologically en agudo disociado cóclea de ratas postnatales. Este método puede ser modificado para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la función y el desarrollo de la célula de pelo interna.
Protocol
Representative Results
Discussion
En las ratas más jóvenes que el día 11, no pudo observarse ningún potencial de acción en respuesta a la estimulación sonora en la corteza auditiva6,7. Por lo tanto, día postnatal 11 se describe como “Inicio de la audiencia”10. El desarrollo de la función auditiva antes de inicio de la audiencia no fue estudiado bien todavía. El método similar para la grabación de ABR adultos, demostramos que abr podría ser provocada por ráfaga…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por becas del programa 973 (2014CB943002) y la nacional Ciencias naturales Fundación de China (11534013, 31500841).
Materials
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
