Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali
Summary
Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.
Abstract
L’esterno della cellula ciliata è uno dei due tipi di cellule ciliate sensoriali nella coclea dei mammiferi. Essi alterano la loro lunghezza di cella con il recettore potenziale per amplificare la vibrazione debole del segnale a basso livello sonoro. La morfologia e la proprietà elettrofisiologiche delle cellule ciliate esterne (OHCs) si sviluppano in età postnatale precoce. La maturazione della cellula ciliata esterna può contribuire allo sviluppo del sistema uditivo. Tuttavia, il processo di sviluppo di OHCs non è ben studiato. Questo è in parte a causa della difficoltà per misurare la loro funzione da un approccio elettrofisiologico. Con lo scopo di sviluppare un metodo semplice per risolvere il problema di cui sopra, qui descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la funzione di OHCs nella coclea acutamente dissociato da ratti postnatali. Con questo metodo, possiamo valutare la risposta coclea agli stimoli di tono puro ed esaminare il livello di espressione e la funzione della proteina motore prestin nel OHCs. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare le cellule ciliate interne (IHCs).
Introduction
Due funzioni distinte di cellule ciliate sensoriali cocleari sono essenziali per l’udito dei mammiferi: trasduzione del mechanoelectric (MET) ed electromotility1,2. Dai canali MET situati nel fascio di capelli, IHCs (IHCs) e OHCs Converti vibrazione sonora in variazioni di potenziale di membrana, come pure i segnali elettrici dei neuroni del ganglio spirale innervate. OHCs cambiano la loro lunghezza di cella con il potenziale di membrana e amplificare la vibrazione del suono di basso livello. Questa attività definita electromotility è derivata dalla proteina motore prestin situato nella parete laterale del OHCs3.
In molte specie, tra cui roditori, la funzione uditiva è immatura in epoca postnatale iniziale4,5. Nessun potenziale d’azione in risposta ai segnali audio potrebbe essere rilevato nella corteccia uditiva prima della udienza inizio6,7. Sviluppo della morfologia e funzione della coclea è stata ampiamente studiate in mouse, gerbillo e ratto4,5,8. La meccanotrasduzione ed electromotility delle cellule ciliate sono anche sviluppati nei primi anni di vita epoca5.
Al fine di valutare la sensibilità di udienza dei ratti a diverse età postnatale, abbiamo sviluppato un metodo per la risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) registrazione nei cuccioli di ratto. Intero-cellula patch clamp è una tecnologia ideale per indagare il OHCs electrophysiologically. Tuttavia, confrontato con il morsetto di patch eseguito in neuroni ed altre cellule epiteliali, il basso tasso di cellule intere tenuta limitata l’inchiesta del electromotility di OHCs isolato.
Qui descriviamo una procedura per studiare il OHCs morfologicamente ed electrophysiologically nella coclea acutamente dissociato da ratti postnatali. Questo metodo può essere modificato per studiare i meccanismi molecolari che regolano la funzione e lo sviluppo della cellula ciliata interna.
Protocol
Representative Results
Discussion
In ratti più giovani di giorno 11, nessun potenziale d’azione in risposta a stimolazione sonora potrebbe essere osservato nella corteccia uditiva6,7. Di conseguenza, postnatale giorno 11 è descritto come “inizio dell’udito”10. Lo sviluppo della funzione uditiva prima insorgenza di udienza non è stato ben studiato ancora. Utilizzando il metodo simile per la registrazione di ABR adulto, dimostriamo che ABRs potrebbe essere suscitata da sc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma del 973 (2014CB943002) e il National Natural Science Foundation della Cina (11534013, 31500841).
Materials
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
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