Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana
Summary
Comme les mitochondries sont seulement un petit pourcentage de la cellule végétale, ils doivent être purifiés pour une série d’études. Les mitochondries peuvent être isolés dans divers organes de la plante par homogénéisation, suivie par centrifugation en gradient de différentiel et densité afin d’obtenir une fraction mitochondriale hautement purifiée.
Abstract
Les mitochondries sont des organites essentiels impliqués dans nombreuses voies métaboliques chez les plantes, notamment la production de l’adénosine triphosphate (ATP) de l’oxydation des composés réduits tels que la nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et la flavine adénine dinucléotide (FADH2). L’annotation complète du génome d’Arabidopsis thaliana a mis en place il comme plante modèle système le plus utilisé, et donc la nécessité de purifier les mitochondries des divers organes (feuilles, racines ou fleurs) est nécessaire pour utiliser pleinement les outils qui sont maintenant disponibles pour Arabidopsis étudier la biologie mitochondriale. Les mitochondries sont isolées par homogénéisation du tissu en utilisant une variété d’approches, suivie d’une série d’étapes de centrifugation différentielle produisant un granulé mitochondrial brut qui est ensuite purifiée à l’aide de gradient de densité colloïdal continue centrifugation. La matière colloïdale de densité est ensuite supprimée par plusieurs étapes de centrifugation. A partir de 100 g de tissus de la feuille fraîche, 2 à 3 mg de mitochondries peuvent être régulièrement obtenu. Respiratoires expériences sur ces mitochondries affichent les taux typiques de 100-250 nmol O2 min-1 mg de protéines mitochondriales total-1 (taux de NADH-dépendante) avec la possibilité d’utiliser divers substrats et inhibiteurs de déterminer quels substrats sont être oxydés et la capacité de l’alternative et cytochrome oxydases terminales. Ce protocole décrit une méthode d’isolement des mitochondries des feuilles d’Arabidopsis thaliana en utilisant des gradients de densité colloïdal continue et une mesure efficace respiratoire des mitochondries végétales purifiée.
Introduction
L’histoire de recherche mitochondriale plante remonte à plus de 100 ans1. Les mitochondries intactes ont été isolées pour la première dans les années 1950 en utilisant la centrifugation différentielle. Mitochondries à être purifié sans souffrir l’ajustement osmotique a permis l’avènement d’un gradient de densité colloïdales dans les années 1980. Tandis que les mitochondries purifiées dégradés ne conviennent pas pour la plupart des cas, en raison de la sensibilité de la spectrométrie de masse, contaminants même relativement mineures peuvent être détectés et peuvent être affectées indûment un emplacement mitochondrial2. L’utilisation de libre circulation électrophorèse peut enlever les deux plastidique et peroxysomes contamination3, mais libre écoulement électrophorèse est une technique hautement spécialisée et n’est pas requis pour la grande majorité des études. En outre, quand déterminer l’emplacement d’une protéine, qu’il faut rappeler que double ou multiple ciblant des protéines se produit dans les cellules. Plus de 100 doubles protéines ciblées sont décrits pour les chloroplastes/plastes et mitochondries4et un certain nombre de protéines ciblées aux mitochondries et peroxysomes sont également connus5. En outre, la re-localisation de protéines sous des stimuli spécifiques, par exemple le stress oxydatif, est un thème émergent dans la biologie cellulaire6. Ainsi, l’emplacement des protéines doit être examinée dans le contexte de la biologie a étudié, et une variété d’approches sont utilisées pour déterminer et vérifier l’emplacement2.
Les mitochondries sont généralement isolés des tissus végétaux par homogénéisation, il faut un équilibre entre rupture ouverte la paroi pour libérer les mitochondries et ne pas endommager les mitochondries. Traditionnellement, avec pommes de terre et chou-fleur, homogénéisation implique l’utilisation d’appareils ménagers blender/centrifugeuse pour faire un extrait liquide dans un tampon avec différents composants pour maintenir l’activité. Isolation des mitochondries de feuilles de pois, (un matériel populaire pour isolement mitochondriale à l’aide de jeunes plants (~ 10 jours), utilise un mélangeur pour lyser les cellules car le matériel de feuille est doux. Avec la disponibilité d’insertional knock out de Arabidopsis thaliana ADN-T, la nécessité d’être en mesure de purifier les mitochondries à réaliser des études fonctionnelles a nécessité l’élaboration de méthodes pour isoler les mitochondries des feuilles, racines ou fleurs tissus. Dans l’ensemble les méthodes mises au point pour les autres plantes a travaillé bien contre7, avec l’accessoire qui broyer du matériel nécessaire pour être optimisé. Pour Arabidopsis, cela peut être réalisé de diverses façons (voir ci-dessous) et diffère entre les types de tissus (racine contre shoot). L’utilisation du gradient continu peut également être optimisée comme la densité des mitochondries des différents organes ou stades moyens ils peuvent migrer différemment. Ainsi, pour séparation maximale, la densité du gradient peut être raffinée pour faire en sorte de réaliser la meilleure séparation.
Une fois purifié la mitochondrie peut être utilisée pour une variété d’études, y compris les expériences d’absorption de protéines et ARNt, tests d’activité enzymatique, chaîne respiratoire et buvardage de western. Mitochondries isolées peuvent également servir pour les analyses de la spectrométrie de masse de l’abondance de la protéine. Ciblé plusieurs réaction suivi des analyses (MRM) permet pour la quantification des définie des protéines, mais nécessitent le développement significatif de dosage. En revanche, quantification de diméthyle ou autres isotopes étiquettes8, fournit une approche de découverte dans l’identification des différences à travers le protéome entier qui peut être utilisé pour découvrir de nouveaux points de vue biologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
En règle générale, isolation des mitochondries de l’Arabidopsis laisse rendements jusqu’à 3 mg de mitochondries d’environ 80-100 3 – 4 – semaine vieilles centrales, bien que les rendements de plus de 5 mg est possible souvent avec ponçage minutieux. Le rendement varie en fonction des conditions de croissance et diminue considérablement comme feuilles sénescentes, bien que la structure de la mitochondrie semble être bien entretenu au cours de la sénescence,9. Une des caractéristiques …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par un australien recherche Conseil Centre d’Excellence en usine énergie biologie CE140100008, une australienne Conseil avenir bourse de recherche (FT130100112) pour MWM et une bourse de recherche Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fondation, Allemagne) au JS.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
