Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio
Summary
Se presenta un protocolo para la síntesis, purificación y caracterización de un inhibidor basado en rutenio de la absorción de calcio mitocondrial. Un procedimiento para evaluar su eficacia en células de mamífero permeabilized está demostrado.
Abstract
Detallamos la síntesis y purificación de un inhibidor de la absorción calcio mitocondrial, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)]5 +. La síntesis optimizada de este compuesto inicia de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 en 1 M NH4OH en un envase cerrado, produciendo una solución verde. Se logra la purificación con cromatografía de intercambio catiónico. Este compuesto es caracterizado y verificada a ser puros por espectroscopia UV-vis e IR. Las propiedades inhibidoras de absorción calcio mitocondrial se evalúan en las células HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescencia.
Introduction
El calcio mitocondrial es un regulador clave de una serie de procesos que son críticos para la función normal de la célula, incluyendo la apoptosis y la producción de energía. 1 , 2 , 3 el calcio mitocondrial uniporter (MCU), una proteína del transportador de iones que reside en la membrana mitocondrial interna, regula el flujo de iones calcio en las mitocondrias. 4 , 5 , 6 inhibidores químicos de la MCU son herramientas valiosas para continuar los esfuerzos para estudiar la función y funciones celulares de esta proteína de transporte y de calcio mitocondrial. El compuesto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, es uno de los inhibidores selectivos de la conocida sólo para el MCU con un valor informado ded K de 24 μm.7 ,8,9,10 este complejo es una impureza común en formulaciones comerciales de rojo de rutenio (RuRed), un triruthenium di-μ-oxo puente hexacation de la fórmula [(NH3) 5 RU (μ-O) Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +, que también se ha utilizado como un inhibidor de la absorción de calcio. Aunque Ru360 está disponible en el mercado, es muy costoso. Por otra parte, la síntesis y el aislamiento de Ru360 es desafiado por purificación difíciles procedimientos y métodos de caracterización ambigua.
Recientemente hemos reportado procedimientos alternativos para acceder a un Ru360 análogo, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 este compuesto inhibe el MCU con alta afinidad, similar a Ru360. En este protocolo, describimos nuestro más eficaz síntesis de este compuesto, que comienza de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificación del producto usando resina de intercambio catiónico fuertemente ácida es detallado, junto con errores comunes de este procedimiento. También presentamos los métodos para la caracterización y evaluación de la pureza compuesto y delinear un enfoque simple para probar su eficacia en el bloqueo de la absorción de calcio mitocondrial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Captación mitocondrial de calcio inhibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 puede ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, una conocida rutenio a partir de material, como se describe en este procedimiento. La síntesis de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 se logra fácilmente con poca dificultad. Después de revolver RuCl3 por 16 h en la hidracina hidrato, el pH de la solución…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la Universidad de Cornell. Este trabajo hizo uso del centro de Cornell para materiales comparten instalaciones de investigación, que son apoyadas a través del programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconoce apoyo de una beca de investigación postgrado en NSF (Grant DGE – 1650441) y el Dr. Dave Holowka para obtener ayuda con los experimentos de calcio. Cualquier opinión, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores (s) y no reflejan necesariamente las opiniones de la National Science Foundation.
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochimie. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of “ruthenium red” responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
