慢性活性泼斯坦-巴尔病毒感染患者 NK 和 T 细胞系建立的高效简便方法
Summary
采用高效、少量外周血、低剂量 IL-2 的方法, 建立了 CAEBV 患者的 NK 和 T 细胞克隆的简便算法。
Abstract
从淋巴瘤或淋巴综合征患者中, 我们已经描述了一些方法来建立 NK/T 细胞系。这些方法使用饲养细胞, 纯化 NK 或 T 细胞多达10毫升的血液, 或高剂量的 IL-2。本研究提出了一种通过添加重组人 IL-2 (rhIL-2), 通过培养外周血单个核细胞 (PBMC) 来建立 NK 和 T 细胞系的新方法, 并使用2毫升的全血。细胞可以在两周内迅速增殖并维持3月以上。用该方法建立了 7 NK 或 T 细胞系, 成功率高。该方法简便、可靠, 适用于多例 CAEBV 或 NK/T 细胞淋巴瘤细胞株的建立。
Introduction
eb 病毒是无处不在的, 不仅感染了 B 细胞, 而且传染了 T 和自然杀手 (nk) 细胞, 这导致了一些 eb 病相关的 NK/T 淋巴疾病 (LPD) 和淋巴瘤/白血病, 如 eb 联合噬血细胞lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme 淋巴瘤, 淋巴结外 nk/T 细胞淋巴瘤, 鼻型和侵袭性 NK 细胞白血病 1, 2, 3.其中包括严重的慢性主动 eb 病毒 (SCAEBV) 疾病, 主要发生在东亚, 现在被认为是由 eb 病毒感染的 T 或 NK 细胞的克隆扩张引起的 LPD4,5,6,7, 但没有明显的免疫缺陷存在于传染性传染性 (IM) 类似的症状, 包括发烧, 肿大, 淋巴结肿大, 肝功能障碍持续或反复, 以及高 eb 病毒-DNA 负荷在外围血液8,9。CAEBV 患者预后不佳10,11, 其发病机制和 eb 病毒的作用尚不清楚。因此, 从 eb 病毒相关的 nk/t 淋巴疾病和淋巴瘤的细胞系是非常有用的细胞模型, 以澄清 eb 病毒诱发 NK 或 t 细胞增殖机制及其与高发病率的白血病或淋巴.
到目前为止, 已经用不同的技术建立了几个单元格线12,13,14,15,16。人类 nk 细胞系由 nk 细胞淋巴瘤/白血病建立, 通过与小鼠基质细胞系进行共培养, 并在 rhIL-2 的浓度为每毫升15。KAI3 是由患有严重蚊子过敏或 SCAEBV 的患者与自体永生细胞系 (拼箱)、乙肝病毒转化的 B 细胞、作为饲养细胞以及在 100 u/毫升16中添加 rhIL-2 的病人建立的另一种 NK 细胞系。SNK6 和 SNT8 通过添加大剂量的 rhIL-2 (700 u/毫升)12, 从鼻 NK/T 细胞淋巴瘤患者的肿瘤组织中获得。与类似的技术, SNK-1 细胞是从 CAEBV 患者, 培养从 PBMC 通过去除 T 细胞和添加 700 u/毫升 rhIL-213,17。SNT13 和 SNT15 是通过删除 CD4+ 和 CD8+ 单元格18建立的。到目前为止, 其他 t 细胞和 nk 细胞系从 eb 病毒-NK/T LPD 患者都开发了此方法19。
上述现有方法的弊端包括: 饲养细胞的使用、高剂量 IL-2 的要求、多达10毫升全血的利用率, 或对 NK/T 细胞的净化, 这在临床上是非常有挑战性的, 因为在开始培养之前, 必须验证 eb 病毒潜伏感染的细胞类型。由于 CAEBV 主要发生在亚洲儿童身上, 所以在所有地区都不容易获得10毫升血液。在本研究中, 我们开发了一种新的简单的方法, 成功率高, 建立 NK 和/或 T 细胞系, 通过培养 PBMC 从 CAEBV 患者使用低剂量的 rhIL2 和2毫升的全血容量, 没有喂食细胞。结果表明, 该方法效率高, 节省时间。
Protocol
Representative Results
Discussion
在该协议中, 建立了 CAEBV 患者全血 NK/T 细胞系的新方法。与现有方法相比, 该方法的主要优点是其简单性和对少量血液的要求, 同时具有较高的成功率和良好的细胞生存条件。此外, 可以通过培养 PBMC 来建立 NK/T 细胞系, 而不确定 eb 病毒潜伏预先感染的细胞类型, 因为这种测定在培养前会消耗更多的血液和时间。另外, 细胞系可以通过细胞系建立后的流式细胞术进行分析, 从而纯化细胞的不同表型。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国科学院重点项目 (KFZD-SW-205)、中国科学院战略生物资源技术支持系统 (CZBZX-1 和 ZSSB-004) 的支持, 并获得中国国家科学基金会资助 (81401640) 和上海自然科学基金 (14ZR1434800)。
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
