Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse
Summary
L’obiettivo di questa tecnica di squash del tubulo è quello di valutare velocemente le caratteristiche citologiche di sviluppare spermatociti di mouse, preservando l’integrità cellulare. Questo metodo consente lo studio di tutte le fasi della spermatogenesi e può essere facilmente implementato al fianco di altri approcci biologici biochimici e molecolari per lo studio di meiosi del mouse.
Abstract
Progressione meiotica nei maschi è un processo che richiede l’azione concertata di un numero di eventi cellulari altamente regolamentati. Errori che si verificano durante la meiosi possono portare alla sterilità, perdita di gravidanza o difetti genetici. Che inizia all’inizio della pubertà e proseguendo per tutta l’età adulta, onde continue semi-sincrone di spermatociti subiscono la spermatogenesi e alla fine formano spermatozoi aploidi. La prima ondata di spermatociti di mouse in fase di iniziazione meiotica appaiono al 10 ° giorno post-parto (dpp 10) e vengono rilasciati nel lume del tubulo seminifero come sperma maturo a 35 dpp. Pertanto, è preferibile utilizzare topi all’interno di questo intervallo di tempo dello sviluppo al fine di ottenere popolazioni altamente arricchiti di interesse. Analisi delle fasi di rara delle cellule è più difficile in più vecchi topi grazie al contributo di successive ondate di spermatogenesi, che aumentano la diversità delle popolazioni cellulari all’interno dei tubuli. Il metodo qui descritto è una tecnica facile da implementare per la valutazione citologica delle cellule trovate all’interno dei tubuli seminiferi dei topi, tra cui spermatogoni, spermatociti e spermatidi. La tecnica di squash tubulo mantiene l’integrità delle cellule germinali maschili isolate e permette l’esame delle strutture cellulari che non sono facilmente visibili con altre tecniche. Per illustrare le possibili applicazioni di questa tecnica di squash tubulo, gruppo fusello è stato monitorato in spermatociti progredendo attraverso la profase alla metafase di transizione (transizione G2/MI). Inoltre, duplicazione centrosoma, inattivazione del cromosoma di sesso meiotica (MSCI) e formazione di mazzo del cromosoma sono stati valutati come esempi delle strutture citologiche che possono essere osservate utilizzando questo metodo di squash del tubulo. Questa tecnica può essere utilizzata per individuare difetti specifici durante la spermatogenesi che sono causati dalla mutazione o perturbazione esogeni, e quindi, contribuisce alla nostra comprensione dei meccanismi molecolari della spermatogenesi.
Introduction
Meiosi sono un evento cellulare complesso in cui un singolo ciclo di replicazione del DNA è seguito da due successivi cicli di divisione cellulare. Diversi eventi di meiosi specifici devono essere coordinati durante le fasi iniziali della meiosi per assicurare la segregazione del cromosoma accurata. Questi eventi comprendono il completamento di ricombinazione omologa, co-orientamento della sorella cinetocori durante la prima divisione meiotica e la perdita graduale della coesina complessi per risolvere chiasmata tra omologhi. Regolazione precisa di questi processi è necessaria per mantenere la fertilità e cromosoma malsegregazione di eventi che possono portare a disturbi dello sviluppo genetici e aborto spontaneo1.
Mentre gli eventi chiavi della meiosi si svolgono sia maschi che femmine, esistono differenze significative di temporale e meccanicistiche tra spermatogenesi e oogenesi2. Ad esempio, durante la meiosi femminile, profase si verifica durante lo sviluppo embrionale e si arresta nella fase di dictyate fino alla pubertà. Al contrario, la spermatogenesi inizia alla pubertà e progredisce in onde tutta la vita adulta senza arresto. Le differenze tra maschio e femmina meiosi sottolinea la necessità di sviluppare metodi che sono specificamente orientate verso valutare questi processi sia spermatociti e ovociti. Attualmente, valutare la progressione meiotica in gran parte si basa sull’uso di cromatina spread3,4,5. Mentre gli spread della cromatina sono utili per studiare i cromosomi meiotici, riescono a preservare l’integrità cellulare, impedendo la valutazione delle strutture cellulari quali mandrino microtubuli, centrosomi, l’involucro nucleare e gli allegati del telomero. Live imaging e tecniche di coltura a lungo termine notevolmente hanno avanzato la nostra comprensione della meiosi femminile; approcci simili per visualizzare l’intera cellula intatta, tuttavia, sono meno frequentemente implementati per lo studio della spermatogenesi6,7. Per visualizzare gli eventi dinamici durante meiosi maschile, abbiamo adattato stabilito tubulo squash tecniche per valutare rapidamente le caratteristiche citologiche di sviluppare del mouse spermatociti8,9. Il metodo qui descritto mantiene l’integrità della cellula, permettendo lo studio di strutture cellulari multiple durante diverse fasi della spermatogenesi.
Questa tecnica di squash del tubulo è un approccio a cellula intera, che consente la valutazione delle strutture cellulari tramite microscopia di immunofluorescenza. Approcci comuni istologici di visualizzare progressione meiotica in di topo maschio come haematoxylin ed eosina di testicoli di paraffina ed etichettatura immunofluorescente di cryosections consentono un’ampia panoramica della progressione meiotica. Tuttavia, queste tecniche non riescono a risolvere le singole cellule nella misura necessaria per un’analisi dettagliata degli eventi che si verificano durante meiosi10,11. Tecniche alternative per visualizzare processi meiotici si basano su interruzioni significative chemiosmotica spermatocita per isolare e difficoltà materiali nucleari3,4,5. Questi trattamenti chimici ostacolano l’osservazione di tipi cellulari diversi da spermatociti primari. Un metodo recentemente descritto da Namekawa ha permesso alla comunità di ricerca di preservare l’architettura nucleare di spermatociti isolati, ma richiede l’uso di un cytospin e accessori che non siano prontamente disponibili per alcuni laboratori4. Al contrario, la tecnica di squash tubulo richiede solo attrezzature che è generalmente standard nella maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule.
Il metodo di squash tubulo qui descritto può essere utilizzato per visualizzare i tipi di cellule diversi trovati all’interno del tubulo seminifero, comprese cellule di sertoli, spermatogoni, spermatociti primari e secondari e spermatidi. Accoppiando questa tecnica con la prima ondata vicino-sincrono della spermatogenesi in topi giovani, è possibile ottenere arricchiti popolazioni delle cellule spermatogenetiche mentre progrediscono attraverso meiosi12. Questo processo permette l’analisi dettagliata dei processi durante la spermatogenesi, quali eventi precoci profase, il G2/MI e la metafase per transizioni anafase e spermiogenesi. Inoltre, preparazioni di squash tubulo possono essere utilizzati per visualizzare le caratteristiche citologiche dei cromosomi (ad es. interchromatid domini (ICD) e cinetocori) e centrosomi (centrioli e pericentriolar materiale/matrici). Il metodo di zucca può essere facilmente eseguito in parallelo con altri approcci sperimentali, come spread della cromatina ed estrazione di proteine. Inoltre, questa tecnica è stata modificata con successo per depositare le cellule spermatogenetiche viventi su slitte per la visualizzazione diretta13.
Il metodo qui descritto richiede una tecnica di squash del tubulo seminifero cellula intera per analizzare la transizione G2/MI in topi C57BL/6J wild-type. Le caratteristiche citologiche di spermatociti primari entrando la prima divisione meiotica sono state visualizzate con microscopia di immunofluorescenza per osservare il fuso meiotico. Questa tecnica versatile può essere facilmente modificata per visualizzare altre fasi meiotic e diversi tipi di cellule. La tecnica è anche favorevole alla strategie di visualizzazione alternativi, come DNA e RNA pesce approcci.
Protocol
Representative Results
Discussion
Topi hanno dimostrato di essere un organismo modello utile per studiare gli eventi cellulari che regolano la progressione meiotica durante la spermatogenesi. Inoltre, è necessario sviluppare strumenti adatta allo studio della spermatogenesi, perché molti eventi, come uscita dalla Profase Meiotica I, sono sessualmente dimorfica. Questo protocollo descrive un metodo di squash tubulo seminifero per la visualizzazione e lo studio delle diverse fasi della spermatogenesi del mouse. Questo metodo mantiene l’integrità cellula…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIGMS (R01GM11755) a P.W.J. e da una borsa di sovvenzione di formazione dal National Cancer Institute (NIH) (CA009110) di S.R.W. e J.H.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
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