נציג של מיצוי מוצק-פאזי נוח מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) עם זיהוי אלקטרוכימי (ECD) נחישות סימולטני של נוירוטרנסמיטרים מונואמין שלוש ושתיים של מטבוליטים שלהם בשתן תינוקות. אנחנו גם לזהות את המטבוליט MHPG כמו סמן פוטנציאלי לאבחון מוקדם של נזק מוחי תינוקות.
החילוץ וניתוח של נוירוטרנסמיטרים קטכולאמין נוזלים הביולוגי הוא בעל חשיבות רבה בהערכת תפקוד מערכת העצבים ומחלות קשורות, אבל המדידה המדויקת שלהם הוא עדיין אתגר. פרוטוקולים רבים תוארו למדידה עצבי על ידי מגוון רחב של כלים, כולל כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC). עם זאת, ישנם חסרונות, כמו מבצע מסובך או קשה לזהות מטרות מרובות, אשר לא ניתן למנוע, תוך זמן קצר, טכניקת ניתוח הדומיננטית היא עדיין HPLC בשילוב עם רגיש אלקטרוכימי או זיהוי fluorimetric, בשל רגישות גבוהה, סלקטיביות טוב שלה. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר רעלני, זיהוי catecholamines עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ECD) בדגימות שתן האמיתי של תינוקות, באמצעות electrospun nanofibers ללא הפרדות צבע המורכב של אתר כתר פולימריים עם פוליסטירן כמו adsorbent, הידוע גם בשם שיטת החילוץ (PFSPE) סיבים ארוז מעבדתי. אנו מראים איך שתן דגימות יכול להיות precleaned בקלות על ידי עמודה וגדוש nanofiber מעבדתי, איך analytes המדגם יכולים להיות במהירות מועשר, desorbed, ולא זוהה במערכת ECD. PFSPE מאוד מפשט את נהלי pretreatment דגימות ביולוגיות, המאפשר זמן ירד, הוצאות, הפחתה של האובדן של מטרות.
בסך הכל, עבודה זו ממחישה פרוטוקול פשוט ונוח לחילוץ מוצק-פאזי מצמידים אל מערכת HPLC-ECD נחישות סימולטני של נוירוטרנסמיטרים מונואמין שלוש (נוראפינפרין (NE), אפינפרין (E), דופמין (DA)) ושניים של שלהם מטבוליטים (3-מתוקסי-4-hydroxyphenylglycol (MHPG), חומצה 3,4-dihydroxy-phenylacetic (DOPAC)) בשתן תינוקות. פרוטוקול הוקמה הוחל להעריך את ההבדלים של catecholamines השתן שלהם מטבוליטים בין תינוקות בסיכון גבוה עם נזק מוחי הלידה ופקדים בריא. ניתוח השוואתי גילה הבדל משמעותי בדרכי השתן MHPG בין שתי הקבוצות, המציין כי מטבוליטים קטכולאמין עשוי להיות סמן המועמד חשוב לאבחון מוקדם של המקרים בסיכון נזק מוחי אצל תינוקות.
קטכולאמין נוירוטרנסמיטורים ותוכנן מטבוליט בנוזלי גוף יכול להשפיע על תפקוד העצבים ומשפיעים האיזון של הברית תגובה לגירוי במידה רבה1. Abnormities עלול לגרום למגוון של מחלות, כגון pheochromacytoma, ganglioneuroma, נוירובלסטומה, הפרעות נוירולוגיות1,2. החילוץ והנחישות של catecholamines בנוזלי גוף הוא בעל משמעות האבחון של מחלות רלוונטיות. אולם, catecholamines בדגימות ביולוגיות קיימות בריכוזים נמוכים, הם בקלות מחומצן. יתר על כן, הם מאוד קשה elute בגלל כמות גדולה של הפרעה בינונית3. לפיכך, זיהוי סימולטני catecholamines, נוזלים ביולוגיים הוא עדיין אתגר.
היו ביקורות מראה כי catecholamines השתן יכולה להיות מידה של מתח, וכי רמות שלהם הם סמנים ביולוגיים חשובים להגיב על גירוי חוש המישוש עיבוד ילודים5. על פי המחקר, כל התינוקות שסבלו מ מקרים מוקדמת נמצאים בסיכון במוח פציעה4,5,6, פציעה עשוי לגרום לשחרור חריגה של catecholamines ו בנושאים הקשורים לתוך הנוזלים. קיימות טכניקות מתקדמות תהודה מגנטית שיכול לזהות נזק מוחי ב שלבים קודמת7,–8. עם זאת, בתוך 48 שעות הראשון, תהליך נורמלי התפתחותיות יגרום פגיעה מוחית קבועה זה לא יהיה ניכר תמונות רפואיות11. חוץ מזה, המשאבים כלי עלות גבוה ויקר, יחד עם גורמים אחרים, לאחראי על כל היחידות neonatal גישה אלו טכניקות הדמיה עצבית מיוחדים. עם זאת, השימוש סמן בקלות נגיש ומעשי (כגון catecholamines ו מטבוליטים שלהם) יכול להתגבר על חסרונות אלה, ההקרנה של סמן בנוזלים אנושי עשוי לעזור באבחון מוקדם של פגיעה מוחית, להוביל בקשה זיהוי של תינוק בן יומו תינוקות הזקוקים neuroprotection9. Catecholamines בשתן יכול להיות אינדקס קל וברור, בגלל הקשר ישיר בין כמות אותם שוחרר לתוך נוזלים ותפקוד neuroactivity.
בין נוזלים ביולוגיים, נוזל מוחי שדרתי (CSF) ודוגמאות פלזמה לא קל להשיג באמצעות הליכים טראומטי הקיים, זה גם מאוד קשה להיפטר הפרעות עקב דבק חלבון ו אחרים זיהומים, המוביל בעייתי, תהליך הדגימה גוזלת זמן מתאים לסערת חוזר על עצמו לזיהוי. בנוסף, לילדים, זה כמעט בלתי אפשרי לתפוס את הדגימות בצורה טראומטית. לכן, דגימת השתן הוא טוב יותר מאשר צורות אחרות של הדגימה, כפי שהוא לא פולשנית, קלה לתפעול, ניתן לעשות שוב ושוב. בדיקות שתן הן שופע קל לאחסן ולהציג יתרון רב על הטפסים האחרים של דגימות ביולוגיות.
השיטות העיקריות לכמת catecholamines, נוזלים ביולוגיים כוללים מבחני radioenzymic10, מקושרים-אנזים מבחני החיסון-sorbent11, voltammetry12 , עדשה תרמי ספקטרומטר13. אבל חסרונות קיימים, כגון פעולות מסובכות, קשה לזהות מטרות מרובות. היום, טכניקת ניתוח הדומיננטית היא ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC)14, בשילוב עם רגישות אלקטרוכימי15 או fluorimetric זיהוי16, בשל רגישות גבוהה טוב סלקטיביות. עם טכנולוגיית ספקטרומטר מסה טנדם, כגון כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטר מסה (LC/MS) ו כרומטוגרפיה נוזלית/מסה ספקטרומטר מסות/מסה (LC/MS/MS), ניתוח כימות נוירוטרנסמיטורים יכולים להשיג גבוה דיוק וספציפיות17,18. עם זאת, הטכניקה MS דורשת מכשור יקר, כמו גם כוח אדם מוסמך באופן משמעותי, מקשה על השיטה להחיל אוניברסלית במעבדות המקובלת ביותר. HPLC-ECD מערכות מצוידים בדרך כלל במעבדות המקובלת ביותר קליני, ובכך הפכו בחירה נפוצה וטובה עבור קבוצות מחקר לשימוש עבור קביעת כימי, אבל הם דורשים את הדגימה הציג לתוך מערכת נקי ושל נפח microscale19. לכן חשיבות רבה כדי לטהר לדחוס את המדגם לפני הניתוח. השיטה הקלאסית עבור השלב טיהור היא מיצוי נוזל-נוזל14,15,20 ו- off-line החילוץ מוצק-פאזי, כולל אלומינה מופעל טור21,22 ו- diphenylborate (DPBA) complexation23,24,25,26.
. לי Myeongho et al. כבר משתמש שרף פולימרי כימית שונה עם אתר כתר כמו adsorbent באופן סלקטיבי לחלץ catecholamines מ שתן מאז 200727. כמו כן, בשנת 2006, הוא Haibo et al. הפגינו בגישה סינתזה נתיישב בשביל boronate זיקה החילוץ byutilizing sorbent functionalizable nanomagnetic silsesquioxane oligomeric לכל מקרה (עתירת) nanomagnetic בסיס מורכב, וליישם אותו העשרת catecholamines ב שתן (לנורה, אפינפרין ו- isoprenaline)28. הם גם ניצל ננו כדי למלא את העבודה, תוך שימוש בטכנולוגיה הנקראת ננו-electrospinning ויוצרים חומר סיבי פולימר ב הננומטרי. תהליך electrospinning ניתן להתאים את קוטר, מורפולוגיה ויישור המרחבי של המוצר באמצעות שליטה את מתח העבודה של שינוי התוכן של הפתרון ספינינג יחד עם פרמטרים נוספים29. לעומת הדיו SPE המקובלת, electrospun nanofibers מתאימים מאוד לחלץ ולהעשיר את המטרה analytes של מטריצה מורכבת, כפי הם מצוידים עם יחס פני-שטח-כדי-נפח גבוה כדי לספוח את analytes עם יעילות גבוהה, ו התערוכה יותר בקלות שבשליטת משטח הכימיות, ומאפשר מצורף בהישג יד של תרכובות היעד. מאפיינים אלה לגרום להם בחירה מוצלחת SPE adsorbents, מאוד לצמצם את מעבדתי ואת desorption כמות הממס30,31,32,33. עבור catecholamines בדגימות שתן, nanofibers electrospun, המורכבת apolymeric אתר כתר עם פוליסטירן (PCE-PS) שימשו באופן סלקטיבי לחלץ שלושה catecholamines (NE, E ו- DA)34. העיתון ציין כי האתר כתר סלקטיבי adsorbed המטרות של NE, E, ודה, שהתבסס על הגיאומטריה הנכון עבור איגוד catecholamines באמצעות יצירת קשרי מימן. התוצאות להציג את אתר כתר גשמי ביעילות, הסרת תרכובות אחרות מפריעות הכלול דגימות ביולוגיות. בהשראת דו ח זה, שיטה פותחה עבור הפקת סלקטיבי catecholamines על ידי שימוש electrospun nanofibers ללא הפרדות צבע המורכב PCE-PS.
בנייר זה, שיטת דיווח בעבר34 שיפור והעסיק לא רק לנתח בהצלחה E, NE, ועל דא, אלא גם שלהם מטבוליטים, MHPG, DOPAC, בשתן. אנחנו גם לחקור אפשרויות חדשות עבור המנגנון של התהליך ספיחה. השיטה מציגה מספק יעילות החילוץ, סלקטיביות עבור analytes חמש, השיטה אומתה בניתוח של שתן מן תינוקות בסיכון גבוה עם נזק מוחי הלידה שולטת בריא.
השיטה PFSPE המוצעת במאמר זה עשוי להיות משמעותי ומשמעותי ביחס שלו במהירות, פשטות ונוחות. Adsorbents להשתמש בפרוטוקול הם electrospun nanofibers, אשר גבוה יחסי נפח באיזור פני השטח, לספוח את analytes עם יעילות גבוהה. ההליך רק צריך כמה מיליגרמים של nanofiber, נפח קטן של הממס eluant, אינו דורש שלב אידוי לרכז את analytes. . הנה, הוצג?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי את הלאומי למדע קרן של סין (No.81172720, לא 81673230), חברתי פיתוח מחקר תוכנית של ג’יאנגסו מחוז מדע טכנולוגיה המחלקה (מס ‘ BE2016741), מדע & טכנולוגיה פרויקט של סין מינהל כללי של פיקוח איכות, פיקוח, בידוד (2015QK055), תוכנית הפרוייקט הפתוח של המעבדה מפתח של התפתחות הילד ולמידה המדע של משרד החינוך, אוניברסיטת דרום מזרח (CDLS-2016-04). אנו בכנות להכיר יואן השיר לבין ליאו פינג שסייעו לנו אוסף דגימות.
200 µL pipette tip | column to contain nanofibers | ||
PCE-PS nanofibers | material for PFSPE extraction | ||
steel rod (about 0.5 mm diameter) | fill the nanofibres into the column | ||
gastight plastic syringe (5 ml) | compress solution into the end of the tip | ||
methanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 67-56-1 | |
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) | Sigma-Aldrich.Inc | A-106408 | complex reagent |
norepinephrine(NE) | Sigma-Aldrich.Inc | A-9512 | analyte |
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) | Sigma-Aldrich.Inc | H1377 | analyte |
epinephrine(E) | Sigma-Aldrich.Inc | 100154-200503 | analyte |
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) | Sigma-Aldrich.Inc | D-9128 | analyte |
dopamine(DA) | Sigma-Aldrich.Inc | H-8502 | analyte |
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) | Sigma-Aldrich.Inc | 858781 | interior label |
acetonitrile | Sigma-Aldrich.Inc | 75-05-8 | eluriant and mobile phase |
phosphoric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7664-38-2 | eluriant |
uric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 69-93-2 | artifical urine |
creatinine | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 60-27-5 | artifical urine |
trisodium citrate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 6132-04-3 | artifical urine |
KCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7447-40-7 | artifical urine |
NH4Cl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 12125-02-9 | artifical urine |
NaHCO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | SWC0140326 | artifical urine |
C2Na2O4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 62-76-0 | artifical urine |
NaSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7757-82-6 | artifical urine |
disodium hydrogen phosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10039-32-4 | artifical urine |
urea | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 57-13-6 | artifical urine |
NaCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-14-5 | artifical urine |
MgSO4.7H2O | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10034-99-8 | artifical urine |
CaCl2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10035-04-8 | artifical urine |
HCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-01-0 | artifical urine |
citric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 77-92-9 | artifical urine and mobile phase |
EDTA disodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 34124-14-6 | mobile phase |
monometallic sodium orthophosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7558-80-7 | artifical urine and mobile phase |
1-heptanesulfonic acid sodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 22767-50-6 | mobile phase |
sodium hydroxide | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 1310-73-2 | mobile phase |
phenylboronic acid column(PBA column) | Aglilent | 12102018 | PBA extraction |
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column | Dikma | 5020-06731 | HPLC column for seperation |
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER | Shimadzu Corporation, Japan | SIL-20AC | auto injection for eluriant |
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation, Japan | LC-20AD | HPLC pump |
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector | Shimadzu Corporation, Japan | L-ECD-60A | detector for the analytes |
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System | Micromeritics, USA | surface and porosity analyzer |