Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem

Primaire cultuur van gedissocieerde neuronen uit regio’s van knaagdier hersenen is een belangrijk instrument dat wordt gebruikt door onderzoekers te observeren van de reacties op pathologically betrokken prikkels. Dergelijke studies hebben echter het nadeel van neuronen in enige 2D en zonder hun gliale steunregeling kijken. Bovendien, tenzij geteeld onder omstandigheden van zeer hoge dichtheid (640 neuronen/mm² of ongeveer 16% van de oppervlakte) waarin het onmogelijk is te volgen de willekeurige uitvloeisel van een dendriet of axon voor meer dan een korte afstand van de cel lichaam, hippocampal neuronale levensvatbaarheid daalt meer dan 4 weken aanzienlijk¹, beperking van het gebruik van gedissocieerde culturen voor uitgebreide studies van leeftijdsgebonden aandoeningen. Het kweken van segmenten van knaagdier hersenen bereid is een aantrekkelijke optie die deze beperkingen overwint door het behoud van een georganiseerde cel architectuur en levensvatbaarheid voor weken of maanden. Voorwaarden voor het behoud van vele verschillende regio’s van knaagdier hersenen in segment cultuur geweest beschreven².

Twee methoden worden veel gebruikt voor langetermijnkweek van hersenen segmenten: kweken op membranen op de lucht-liquid interface³ of kweken op coverslips in verzegelde buizen kan draaien in een incubator van de roller om beluchting⁴. Segmenten gekweekt op membranen kunnen rechtstreeks worden beeld met hoge-resolutie fluorescentie microscopie via een rechtop Microscoop en water onderdompeling doelstellingen⁵. Als alternatief, plakjes gekweekt op membranen zijn overgedragen aan glazen bodem gerechten om goede oplossing van dendritische spines met behulp van een omgekeerde Microscoop⁶te bereiken. Echter zijn beide methoden van imaging segmenten geteeld op membranen open systemen die vereisen middellange wijzigingen en vaak Antimycoticum en/of antibiotica te gebruiken om te voorkomen of verminderen van verontreiniging^5,6. Segmenten op een membraan op de lucht-medium-interface onderhouden uitstekende morfologie en overleving, maar terug te keren naar exacte locaties tijdens herhaalde beeldvorming bij hoge vergroting is uiterst moeilijk, tenzij het experiment alleen kleine groepen van cellen volgt geeft uiting aan een fluorescerende marker. Hoewel segmenten geteeld op membranen zijn gebruikt met virale-gemedieerde expressie van transgenen^5,6, vereist bioveiligheid protocollen een gesloten cultuur-systeem worden gebruikt voor bepaalde virale vectoren die worden gebruikt voor uitdrukken van fluorescently geëtiketteerde eiwitten en verslaggevers van celfysiologie. Bovendien vereisen de onderdompeling doelstellingen decontaminatie tussen monsters die wordt gevolgd in cultuur⁵. Een belangrijke toepassing van membraan interface culturen is het combineren van high-resolution beeldbewerking met electrofysiologie op keer punten⁷.

De roller buis methode met coverslips in de kunststof buis niet elke electrofysiologie of hoge resolutie imaging zonder het verwijderen van het dekglaasje aan toe. Dus, deze methode is meestal vereffend langetermijnstudies waarin na fixatie opmerkingen hebben gesteld⁸. Hier wordt beschreven, is een methode die maakt gebruik van de roller techniek voor de cultuur van de buis maar op geboord-out buizen met plakjes op coverslips die herhaaldelijk beeld kan worden voor zo lang als de culturen worden gehandhaafd. Het gesloten systeem vereist geen middellange verandering voor imaging en maakt gebruik van photoetched coverslips om fiducial merken waarmee imaging op hoge vergroting, na dagen of weken, de precieze velden eerder beeld.

Wij hanteren deze methode te onderzoeken van wijzigingen in het knaagdier zeepaardje, een grote hersenen regio betrokken bij geheugen en leren. De knaagdieren hippocampus is vaak bestudeerd als een model voor pathologische of leeftijd-gerelateerde veranderingen waargenomen tijdens de ontwikkeling van cognitieve stoornissen⁹, zoals die zich in AD voordoen. Onze methode is bijzonder goed geschikt voor het bestuderen van pathologische veranderingen die zich binnen een enkel sneetje na verloop van tijd in reactie op veranderingen in het milieu, zoals verhogingen in Aβ peptides ontwikkelen, die is kenmerkend voor AD⁸. Een pathologie, gekoppeld aan menselijke en knaagdier AD brein is de aanwezigheid van cofilin-actine aggregaten en staven, de laatste met bundels van filamenten waarin cofilin en actine zijn in een 1:1 verhouding van de molaire^10,11,^{, 12}. staven zijn waargenomen in vaste segmenten van rat hippocampus na Aβ behandeling, alsmede binnen een segment van de levende knaagdieren hersenen cofilin-GFP onderworpen aan hypoxie⁸uitdrukken, en zij kunnen bijdragen tot de synaptische dysfunctie gezien in AD en beroerte. Hier gebruiken we deze nieuwe kweken methode om het observeren van het tijdsverloop en de distributie in de segmenten van uitgedrukt exogene chimeer fluorescente proteïnen die leidt door verschillende virussen. Vervolgens gebruiken we de neuronale specifieke uitdrukking van een cofilin verslaggever construct te volgen van de ontwikkeling van cofilin staaf en statistische Pathologie in hippocampal plakjes in reactie op behandeling met oplosbare Aβ oligomeren (Aβ_o).