쥐의 뇌에 지속적인 약물 주입 시스템 주변 포도 당 옹 졸 Hypothalamic 인슐린 신호를 공부
Summary
이 프로토콜은 길 항 근, 메트로CCL5, 마이크로 삼 투 펌프 뇌 주입 시스템을 사용 하 여 쥐의 뇌에 전달 하 여 시상 하 부에 chemokine (C C 모티브) ligand 5 (CCL5)의 역할을 연구 합니다. 이 일시적인 억제 CCL5 활동의 중단 hypothalamic 인슐린 신호, 포도 당 옹 졸 및 주변 조직의 인슐린 감도.
Abstract
인슐린 시상 하 부 및 주변 인슐린 응답에서 체계적인 물질 대사를 통제 한다. 주변 adipose 조직에 염증 반응 타입-2 당뇨병 mellitus (T2DM) 개발 및 시상 하 부의 식욕 조절에 기여 한다. Chemokine CCL5와 C C chemokine 수용 체 타입-5 (CCR5) 레벨 2 형 당뇨병 mellitus (T2DM)에 동맥 경화 증 및 포도 당 옹 졸을 중재 제안 되었습니다. 또한, CCL5 역할을 신경 내 분 비는 시상 하 부에 음식 섭취 량과 신체 온도, 따라서, 규제 hypothalamic 인슐린 신호에 그것의 기능 및 주변 포도 당 물질 대사의 규칙을 조사 하 라는 한다.
삼 투 마이크로 펌프 뇌 주입 시스템은 CCL5 기능을 조작 하 고 두뇌에 미치는 영향을 연구 하는 신속 하 고 정확한 방법. 그것은 또한 유전자 변형 녹아웃 동물을 생성 하는 편리한 대체 접근 방식을 제공 합니다. 이 시스템에서 CCL5 신호는 마이크로 삼 투 펌프를 사용 하 여 그것의 길 항 근, 메트로CCL5의 intracerebroventricular (ICV) 주입에 의해 차단 되었습니다. 주변 포도 당 물질 대사 및 인슐린 응답 구두 포도 당 내성 검사 (OGTT) 인슐린 내성 시험 (ITT)에 의해 발견 되었다. 인슐린 신호 활동 다음 동물에서 파생 된 조직 샘플에서 단백질 오에 의해 분석 되었다.
메트로CCL5 주입, 포도 당 대사와 인슐린의 7-14 일 후 응답 OGTT와 ITT의 결과에서 보듯이 마우스에서 손상 되었다. 국세청-1 serine302 인 산화 증가 했다 고 Akt 활동 쥐 hypothalamic 신경 CCL5 억제 다음에 감소 되었다. 모두, 우리의 데이터 마우스 뇌에서 CCL5를 차단 국세청 1 S302의 인 산화를 증가 하 고 좋습니다 hypothalamic 인슐린 신호, 포도의 장애 뿐 아니라 주변 조직에 인슐린 기능 저하로 이어지는 중단 대사입니다.
Introduction
인슐린에는 다양을 한 조직 두뇌를 포함 하 여 영향을 줍니다. 인슐린 혈액-뇌 장벽 통과, 중앙 신경 시스템 (CNS)를 입력 하 고 음식 섭취 량, 공감 활동, 그리고 주변 인슐린 응답을 조절 하는 시상 하 부에 인슐린 수용 체 (IR)를 바인딩합니다. 주변 adipose 조직에 만성 염증 2 당뇨병 mellitus (T2DM), 입력을 하 제안 되었습니다 하지만 조직의 인슐린 응답 및 포도 당 옹 졸을 중재 하는 시상 하 부에 신호 이러한 염증 성 반응 인슐린에 미치는 영향 불분명 남아 있습니다. 식욕 조절 및 종양 괴 사 인자-알파 (TNFα), 인터 루 킨 (IL)-6, 일리노이-1β, 같은 시상 하 부1 신체 온도 조절에 참여 하는 일부 발산 monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1), 및 CCL5 (C C 모티브 ligand 5 ). 또한, 시상 하 부에 염증이 인슐린 저항 T2DM2,3에 이끌어 낸다.
이 발산, chemokine CCL5의 식 레벨의 변경 및 그 수용 체, 중 CCR5, adipose 조직에 연결 되었습니다 인간 동물에 있는 T2DM에 동맥 경화 증 및 포도 당 편협과. CCL5는 또한 신경 내 분 비 기능, 시상 하 부에 음식 섭취 량과 신체 온도의 규정을 포함 하 여 있다. 그것은 따라서 CCL5는 시상 하 부 또는 주변 조직 내 인슐린 신호 활성화에 참여 하는지 여부를 조사 하는 것이 중요입니다.
인슐린 신호 세포 내에서 밀접 하 게 통제 된다. 인슐린 인슐린 수용 체 (IR)의 바인딩 활성화 인슐린 수용 체 기질 (국세청) 단백질, phosphatidylinositol 3-키 (PI3K) 및 단백질 키 니 아 제 B (PKB/AKT) 활성화 및 포도 당 운송업 자-4 (GLUT4) 막 전4 . 국세청 단백질은이 신호 통로 키 레 귤 레이 터: 그들은 긍정적인 반응에 phosphorylated 수 여러 티로신과 떠들고 잔류물 또는 부정적인 인슐린 신호5. 예를 들어 국세청-1에 인 산화 떠들고 302 IR에서 국세청-1의 물리적 분리를 리드 하 고 인슐린 신호 변환, 인슐린 저항6선도 차단 수 있습니다. 시상 하 부에 있는 국세청 단백질의 활동 장애 인슐린 저항과 포도 당 편협 쥐7을 유도 하기 위해 표시 되었습니다.
한 일반적인 방법은 특정 유전자의 기능 연구 대상 유전자는 유 기체의 몸 전체에 걸쳐 분산 식의 조작 이다. 그러나,이 몇 가지 단점이 있을 수 있습니다: 1) 그것은 시간이 지남에 따라 다른 피드백 규제 또는 보상 효과 생성할 수 및 2)이이 방법은 특정 뇌 영역에 대상 단백질의 역할을 보여주는 우리 도움이 되지 않습니다. 또한, 조직 및 세포 관련 유전자 녹아웃 동물 번 식 하는 데 시간이 오래 걸릴 하 고 비용이 많이 드는. 따라서, 우리는 단기 뇌 주입 삼 투 펌프 시스템-길 항 제 약물을 사용 하 여 앞서 언급 한 문제를 극복 하기 위해 뇌에서 대상 단백질의 신호를 방해 하는 상대적으로 신속 하 고 편리한 방법 사용 합니다. 복잡 한 수술 기술 및 계측 시간에 광범위 한 투자를 요구 하는 데 사용 하는 정위 적 주사. 이 프로토콜을 정위 적 주입 및 혈당의 농도 감지 하 여 신호 규정 hypothalamic 인슐린에 CCL5의 역할을 조사, 덜 해로운 빠르고 즉각적인 메서드를 수행 하는 간단 하 고 안전한 방법을 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
만성 염증 및 CCL5 등의 수용 체-관련된 발산의 메커니즘은 타입-2 당뇨병의 발전에 CCR5 불분명 남아 있습니다. 만성 adipose 조직으로 대 식 세포 침투 하면 염증과 adipokines;의 규칙에 영향을 미치는합니다 반면에, 그것은 또한 β 세포를 유치 하 고 독도 Langerhans 혈액 포도 당에 대 한 응답에서에서 인슐린 분 비를 손상. 뇌의 시상 하 부 식욕, 말 초 혈액 포도 당 대사 및 인슐린 응답 통제에 조직의 주변 조직에서 인슐린 및 adipokine 신호를 조정에 제어 센터로 중요 한 역할을 한다. 많은 연구는 또한 hypothalamic 염증 에너지 항상성 결함이 있는 췌 장의 작은 섬 및 간 기능2,3,,910의 결함이 규제로 연결 다는 것을 나타냅니다. CCL5는 뇌의 시상 하 부11,12; 음식 섭취 량과 신체 온도 조절에 기여 그러나, hypothalamic 및 조직의 인슐린 신호를 CCL5의 상관 관계는 명확 하지 않습니다. CCL5 몸 전체 녹아웃 마우스를 (CCL5-/-) 혈액8높은 혈액 포도 당 수준 높은 인슐린 수치와 인슐린 저항 형에서는이 문제를 해결 하기 위해 생성 되었습니다. 그러나, T2DM 표현 형을 개발 하는 데 오랜 시간이 필요 하 고 역할 및 가능한 장기 보상 효과 인해 hypothalamic 인슐린 신호에 CCL5의 메커니즘을 조사 하기 어렵습니다. 따라서, hypothalamic 신경에 있는 신호 CCL5의 직접적인 조작 최상의 접근 이다. 그러나 있다,, 여러 유형의 hypothalamic 지역에서 신경 되며 꽤 비싸고 셀 특정 녹아웃 쥐를 생성할 수 있습니다. ICV를 활용 하 여 주입 시스템 수 있습니다 따라서 저장 시간 하 고 우회 가능한 주변 염증 성 반응, 뇌에 직접 CCL5 기능을 조작 하는 보다 구체적인 접근을 제공.
삼 투 펌프를 이용 하 여 연구 이미 출판 되었습니다 이전, 좋은 예제와 설치류13삼 투 펌프의 이식에 관련 된 기술의 데모를 제공 하. 그러나, 우리는 우리의 연구에 이러한 프로토콜을 수행 하는 동안 몇 가지도 전에 직면. 첫째, 프로토콜에 사용 되는 장비 중 일부는, 1) 위치, 그리기 및 마우스 뇌, 마우스 체온과 3) 산소-isoflurane 유지 하기 위한 온도 시스템 2)는 바늘 삽입을 도달 전기 시스템을 포함 한 쥐를 마 취를 관리 하기 위한 시스템을 제공 합니다. 둘째, 다른 기사에서 설명한 기술을 복제 있었습니다만 우리의 연구에 대 한 동물의 몸 무게와 특정 나가에 작은 범위 내에서 사용할 수 있기 때문에 곤란 했다. 우리는 큰 쥐가 더 수술 및 이식에 적합 알고입니다. 그러나, 우리의 연구에서 우리를 사용 했다 작고 젊은 쥐 비만 및 인슐린 및 혈액 포도 당 규칙에 노화 효과: 몸 가진 남성 마우스 무게 25 ± 2 세대와 나이만 약 2 개월 된 연구에 선정 됐다. 따라서, 마우스 머리에 상처를 봉합 하 고 수술을 수행 하기가 어렵습니다. 셋째, 염증 반응 염증 성 cytokine이 연구에서 대상 이므로 수술 후 최소화 될 수 있다. 생쥐와 쥐 봉합 사를 제거 하 고 염증 발생 및 chemokine 반응 증가, 수술 후 상처를 쉽게 열 수 있습니다. 따라서, 위치를 도달 하 고 그리고 이차 감염을 방지 하는 쥐의 뇌에 바늘을 삽입 하는 전략은 필요. 따라서, 우리는이 기술은 비용 효과적인, 쉽고 게 덜 해로운 동물, 다음 단락에 설명 된 대로 앞에서 설명한 프로토콜 수정.
첫째, 우리는 단계 2.6에에서 설명 된 대로 수동으로 두개골에 표시 된 대상 주변에 구멍을 드릴 네일 드릴을 사용 합니다. 이 방법은 비용 효과적 이며 마우스 meninges과 혈관의 손상을 방지 하기 위하여 전체 절차를 모니터링할 수 있습니다. 혈액 포도 당 규칙은 급성 뇌졸중, 뇌에서 출혈 등 후 장애인 이다. 급성 고 혈당과 당뇨병 같은 증후군 또한 임상 설정14,15스트로크 후 관찰 되었다. 마찬가지로, 우리 또한 장애인된 포도 당 수준과 인슐린 응답에서에서 발견 출혈과 고름 쥐 두뇌에서. 우리는 더 나은 제어 수동 기반 수술의 결과의 일관성을 보장 하기 위하여 필요한가. 둘째, 우리는 수술, 따라서, 바늘을 피하 하 고 치유의 속도 가속 마우스 머리에 인감 피부 클리닉, 조직 접착제 접착제 (단계 2.8)에서 통용 새로 개발된 된 의료 소재 활용을 했다. 이 수술 절차를 보다 쉽게 수행 하 고 보조 염증의 가능성을 줄여 줍니다. 셋째, 전체 수술 절차를 수행 하는 데 필요한 시간은 비교적 짧은 쥐에 대 한 생존의 기회를 증가 하 고 intraperitoneally 주입 되 고 마 취 약물의 복용량을 낮춘 다. 우리는 높은 생존 율 (95%)을 관찰 하 고이 수정 된 프로토콜에 따라 상대적으로 정확한 결과 얻을.
이 기술의 한계는 약물 전달의 상대적으로 짧은 기간 이다. 비록 삼 투 펌프 놓일 수 있다 마우스 몸 안으로 또는 주변 조직의 인슐린 신호를 조절 하는 뇌에 염증 chemokine 효과에 초점을 맞추고 두뇌, 우리의 연구만을 재개 하지 않고. 주변 조직에 추가 수술 수 다음 염증 chemokine 식 증가 하 고 결과 영향을 미칠 것 이라고 주변 조직에 염증 성 반응을 유도 하 고 가능 하 게. 둘째, 약물의 반감기는 또한 연구 기간을 제한합니다. Chemokine 등 재조합 단백질에는 보통 짧은 하프 라이프, 하지만 그것은 또한 짧은 기간 동안 두뇌에 신호 차단 CCL5의 효과 연구를 우리가 수 시간이 지남에, 그것의 활동을 잃는 있다. 우리의 이전 연구는 또한 장기 효과8모델을 제공 하는 CCL5 녹아웃 마우스를 생성 하기 위한 유전자 조작 방법 설명.
몇 가지 새로운 기술과 뇌에 약물을 전달 하기 위해 다른 방법이 있다. 나노기술 중앙 신경에 약물을 전달 하는 데 사용할 수 있는 강력한 기술입니다. 그러나, 많은 약물은 열에 민감한 고 나노16에 그들을 포장 하려고 할 때 파괴 될 수 있다. 또한, 나노 입자 BBB를 통과할 수 있으며 siRNA 또는 가장 일반적인 약물에 대 한 적합 한 세포에 의해 uptaken 하지만 그것은 ligand 수용 체 바인딩에 대 한 이상적인 방법.CCL5 그것의 수용 체, CCR5, 효과8을 시상 하 부 아크 뉴런에서 바인딩이 필요한 지와 CCL5 길 항 근 메트로CCL5 나노 입자를 통해 뉴런으로 전달 바인딩 및 세포에 CCR5 차단 하는 능력의 손실 될 수 있습니다. 표면입니다.
혈액 포도 당 수준의 마우스 컨트롤 (마우스 실제 관리)에 비해 CCL5 적 메트로CCL5 경구 포도 당 내성 검사에서 관리에 상당히 높았다. 추가 인슐린 관리 (인슐린 내성 검사) 또한 수 없었다 혈액 포도 당 수준을 낮출 메트로CCL5에서 받은 쥐 (그림 4B), 외부와 내 생 적인 인슐린 혈액 포도 당 수치를 줄일 수 없는 제안 때 hypothalamic CCL5 신호 차단. 쥐 시상 하 부에 CCL5 활동 없이 인슐린 저항 되었다. 국세청-1의 증가 serine302 인 산화는 메트로 CCL5 실제 (그림 5A-B)를 받는 통제 쥐에 비해 받는 쥐에서 발견 되었다. 국세청-1의 인 산화 떠들고 302 인슐린 저항6;의 주요 원인인 인슐린 수용 체에서 국세청-1의 물리적 분리를 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 인슐린은 PI3K Akt 통로 같은 하류 신호를 활성화할 수 없습니다. Ex vivo 인슐린 자극 연구를 확인 하류 신호 분자 Akt (p AktS473) 하지 마우스 hypothalamic 조직에서 인슐린에 의해 활성화 된 인슐린 주입 메트로-CCL5, 떠들고 302 인 산화가 증가 하는 대신. 전부, 생리 데이터 (OGTT와 ITT) 및 분자 연구는 체계적인 인슐린 저항과 포도 당 물질 대사에 기여 hypothalamic 인슐린 신호 규정, 중재 hypothalamic CCL5 신호를 보여줍니다.
역할 및 비만 관련 된 당뇨병에서 CCL5의 CCR5 메커니즘 불분명 남아 있습니다. Kitade 그 외 여러분 보고 CCR5 부족 비만 유발 염증, 대 식 세포 신규 모집, 및 인슐린 저항17에서 쥐를 보호. 그러나, 케네디 그 외 여러분 에 의해 다른 연구 CCR5 부족 체형과 근육 인슐린 신호18로 서 조직의 포도 당 내성 손상 나타내는 반대 결과 발견. 두 연구는 비만, 전신 만성 염증, 보상 응답을 유도 하 고 지방 다이어트를 적용. 이 연구는 인슐린 신호 규정 CCL5 및 CCR5의 깨끗 하 고 명확한 메커니즘을 제공 하지 않았다. 다른 한편으로, 삼 투 펌프 기술 두뇌 특정 주입 있으며 시간 제한 배달 보상 응답을 피 한다.
결론적으로, 뇌 주입 시스템 삼 투 펌프 “구식” 방법 것 처럼 보이지만, 저렴, 쉽게, 그리고 덜 해로운 약물 전달 방법 제공 및 수 조사에서 신호 ligand-수용 체의 기능에 두뇌입니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 감사에서 과학과 기술, 대만-담배 제품의 MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) 및 건강 및 복지 요금-MOHW106-TDU-B-212-144001 S Y c 지원
Materials
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
| LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
| Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
| Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
| Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
| Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
| Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
| MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
| CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
| aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
| Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
| Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
| Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |
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