单细胞下游特征的靶细胞预富集与全基因组扩增

所有程序都已获得格拉茨医科大学道德委员会 (25-240 前 12/13) 的批准。外周血用于扣球实验的样本来自健康的个体。 注: 本协议描述从 PBS 中分离 HT-29 细胞 (人结肠癌细胞系) 或从 HT-29 细胞和外周血的人工混合。同样的实验与两个额外的细胞系 (LNCaP 和 VCaP, 实验数据的代表性结果) 进行, 并可以在理论上执行所有细胞表达 EpCAM。 1. 靶细胞的制备 细胞的细胞培养和标记注意: 在这个协议中, 细胞是培养在 75 cm²培养瓶。如果使用其他细胞培养设备 (例如25 cm²培养皿、6孔板、等), 请相应地调整试剂的数量。所有液体使用在水浴前预热到37°c。如果不另行说明, 则所有协议步骤均在室温 (RT) 中执行。 培养 HT-29 细胞在麦考伊的5a 改良培养基补充2毫米 l-谷氨酰胺, 20 毫米 Hepes, 10% 胎牛血清 (血清), 1% 青霉素/链霉素在37摄氏度在 5% CO2大气。 当细胞90% 汇合时, 取出培养基, 用10毫升的 1x PBS 冲洗细胞。 要收获细胞, 添加2毫升的细胞脱离溶液 (材料表和试剂) 到细胞和孵化细胞约5分钟在37摄氏度。注: 分离液中含有蛋白水解和 collagenolytic 酶的 1x PBS, 0.5 毫米乙二胺乙酸 (EDTA), 3 毫克/升苯酚红色。将细胞脱离的预热时间减少到最低限度, 因为这将在1小时后不活跃, 在37摄氏度。覆盖整个细胞层以获得最佳细胞脱离。 用倒置显微镜检查细胞的脱离。 将所有分离的细胞转移到50毫升管预先填入与10毫升细胞培养培养基 (相同的步骤1.1.1 中使用) 和并用重悬细胞吹打。 将剩余的电池悬浮液放在 RT 上的卧式滚筒搅拌机上, 然后进入标签步骤。 靶细胞的活细胞标记 稀释1µL 5 毫米 CFSE (供应在二甲基亚砜, 亚砜) 在1毫升 1x PBS 预热在37摄氏度, 以获得5µM 现成使用 CFSE 标签解决方案。注: 为了获得最佳染色效果, 请使用新的准备好的解决方案。 在 1x PBS 中准备一个随时可用的 DNA 染色溶液 (材料和试剂表), 并将其存储在 2-6 摄氏度的保护下免受光照。注: 为了获得最佳染色效果, 请使用新的准备好的解决方案。 从水平滚子混合器 (步骤 1.1.6) 中获取单元格, 并将单元格放置在 300 x g上以10分钟. 取出上清, 并并用重悬10毫升 1x PBS 中的细胞。 再次冲洗细胞与 1x PBS 和并用重悬细胞颗粒在500µL 准备使用 CFSE 标签解决方案。 在37摄氏度的细胞孵育15分钟, 然后在 300 x g的离心后收集细胞3分钟。 并用重悬1毫升的预预热细胞培养培养基中的标记细胞, 并允许细胞再生37摄氏度30分钟。 通过离心 300 x g以3分钟的方式收割细胞, 并在1毫升的准备使用的 DNA 染色溶液中并用重悬细胞颗粒, 在37摄氏度为10分钟。 颗粒细胞, 去除上清和并用重悬细胞在4毫升 1x PBS。使用 hemocytometer 对细胞密度进行评估, 并使用装有 4 ‘、6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 和荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 过滤器(图2A 和 2E) 的荧光显微镜检查荧光标签. 离心细胞在 300 x g为3分钟, 并并用重悬细胞颗粒根据所需的细胞密度的各自实验, 如给在下一节和地方在冰上。 2. 充电导线 注: 细胞可以从目标细胞/外周血史派金在毫升尺度或提供低数量的细胞在微升的比例。前者的方法允许模仿外周血中的稀有细胞条件, 但后者可能是附加少量细胞以进行协议优化/测试的首选方法。 用大量细胞悬浮剂对导线进行充电 通过将0.8 克 bsa 分解为40毫升 1x PBS (细胞培养使用), 制备 2% bsa 阻断溶液。在 10-20 分钟的水平滚筒搅拌机上, 通过初始涡流和后续孵化, 将 BSA 溶解。 用2毫升 2% BSA 冲洗空 EDTA 管/肝素钠管, 除去抗凝剂残留物并丢弃溶液。用5毫升 2% BSA 在水平滚筒搅拌机上以 15 rpm 为30分钟, 通过在 RT 上孵化的方式阻断管表面, 并丢弃溶液。 稀释标记细胞 (1.2 节) 到密度为 100 000 细胞/毫升, 并使用5毫升来充电导线。 添加5毫升的标记细胞悬浮 (总共 500 000 细胞) 到管。在添加细胞悬浮液时避免气泡。 卸下存储舱内的电线, 以及持有电线的橡胶帽, 并在 1x PBS 中冲洗 (图 3)。 在注射器针 (20G) 的帮助下穿透 EDTA 管的橡胶管帽 (步骤 2.1.4), 插入导线, 使功能部分完全沉浸在细胞悬浮中, 当瓶盖回到管子上, 管放在倾斜的滚筒搅拌机上时。注: 在整个充电过程中, 导线的三重螺旋功能部分应覆盖电池悬浮。 将倾斜滚筒搅拌机上的管子旋转5转30分钟, 以允许电池附着在导线上。 用5毫升 1x pbs 冲洗电线, 在 2-6 摄氏度的15毫升管中将其存储在黑暗中, 直到目视检查。注意: 电线的功能部分必须始终被淹没在 PBS 中, 以避免损害细胞。 将靶细胞与外周血人工混合物隔离 (替代充电方法: 2.1。用大量的细胞悬浮物充电导线) 稀释标记细胞 (1.2 节) 获得高细胞密度的细胞悬浮 (> 1 000 000 细胞/毫升), 从而保持细胞悬浮量增加到外周血低。 增加500到 500 000 细胞到5毫升的外周血, 并通过反转管混合。 将电线从存储舱中取下, 取下持有电线的橡胶帽, 并在 1x PBS 中冲洗。 使用注射器针 (20G) 穿透新的管帽与设备的非功能部分, 使功能部分完全沉浸在尖血的时候, 当瓶盖是回到管和管放置在倾斜的滚筒搅拌机。注: 在整个充电过程中, 导线的三重螺旋功能部分应覆盖电池悬浮。 在5转30分钟的 RT 上, 在倾斜的滚筒搅拌机上孵化管。 在 1x pbs 中冲洗电线3次, 并将其存储在15毫升的管中, 包含 1x pbs, 直到目视检查。注意: 电线的功能部分必须始终被淹没, 以避免损害细胞。 从低容量电池悬浮线充电 (替代充电方法: 2.1。用大量的细胞悬浮物充电导线) 在 1x PBS 中并用重悬 1 000 000 细胞/毫升的标记细胞。 在机架上水平固定150毫米一次性玻璃巴斯德吸管。 将电线从存储舱中取出, 但要保持黄色橡胶帽持有导线。 将导线放在吸管中, 使功能性部分位于不接触玻璃的巴斯德吸管的尖端。注意: 导线的尖端不应伸出巴斯德吸管尖端。避免堵塞巴斯德吸管尖端的后端与持有电线的橡胶帽。如果连接紧, 细胞悬浮不能从另一侧加载到吸管尖端。 负载15µL 的细胞悬浮到巴斯德吸管的尖端, 覆盖功能性的部分电线。 每分钟用10分钟的时间, 将组装好的电线/巴斯德吸管尖孵化出来。 从巴斯德吸管尖端拔下电线, 在5毫升的 1x pbs 中冲洗, 并将其存储在 2-6 °c 的15毫升管中, 包括 1x pbs, 直到目视检查。注意: 功能部分必须始终被淹没在 1x PBS, 以避免损害细胞。 3. 计算导线上的细胞数 注意: 始终保持线的功能部分淹没在 1x PBS, 以避免损害细胞。 使用润滑脂笔在玻璃滑梯上绘制矩形区域, 并添加500µL 1x PBS。 将导线的非功能部分弯曲, 将其放在玻璃滑梯上, 使功能部分浸入 1x PBS 中。注: 适合矩形面积和 1x PBS 体积, 完全覆盖导线的功能部分。使用双面胶带安装在幻灯片上的电线的非功能部分。 目视检查导线两侧以枚举捕获的单元格 (图 2B 和 2F)。注意: 细胞的存在是用荧光显微镜来确定的, DAPI 和 FITC 都装有过滤器。导线的两边可以被检查, 并且细胞的数量被评估 (为高细胞数) 或计数 (仅可行, 如果少量细胞被连接到导线)。如果不需要单元格枚举, 则可以跳过此步骤。 扫描后, 将导线放回包含 1x PBS 的15毫升管 (见2.3.6 的注意事项和第3节), 在黑暗中储存电线。注意: 大多数的非功能部分的导线可以被切割 (包括弯曲) 和删除放松存储。 4. 目标细胞的脱离和恢复 注: 分离后应在4小时内完成细胞脱离。 4毫克的释放缓冲组件 (材料和试剂表) 每毫升 1x PBS 和过滤解决方案通过一个0.2 µm 无菌过滤器, 以获得现成使用的缓冲区。注: 该线的聚合物由水凝胶组成, 其功能是抗 EpCAM 抗体, 允许绑定到 EpCAM 呈现的靶细胞。释放缓冲器含有一种能裂解水凝胶的碳氧水解酶。蛋白水解裂解导致聚合物的降解, 从而使捕获的细胞脱离。 预热释放缓冲器在37°c 为5分钟。 添加1.6 毫升释放缓冲, 以填充1.5 毫升的反应管。注: 为1.5 毫升反应量设计的管允许应用1.6 毫升, 这是必要的淹没的功能部分的电线。 在37°c (水浴) 的释放缓冲器中孵化出导线的功能部分, 20 分钟. 使用带导线的橡胶帽代替管帽固定1.5 毫升管中的导线, 以避免在水浴中孵化时受到污染。 将电线/管总成转到 RT 上的振动筛, 500 转15分钟。注: 振动筛有1.5 毫米的轨道。 将电线/管组件放置在离心机中, 并将其旋转 300 x g以10分钟。 从管中取下导线, 关闭瓶盖, 再在 300 x g上离心管10分钟。注: 电线可以存储在 1x PBS 2-6 °c 在黑暗中的细胞计数, 以评估支队效率/检查的细胞留在电线上。 为了减少细胞悬浮液的体积, 去除除100µL (微操作系统) 或另一种300µL (cytocentrifugation 和随后的激光显微切割) 的上清, 并立即进行单细胞取样。 5. 单细胞取样 微操作系统注: 单个细胞将被添加到2µL 细胞裂解主混合允许 WGA。根据要处理的单元数准备主混合, 计算额外的体积, 以减少由于吹打和地方细胞裂解主混合在冰上。 根据 Czyż et al18所概述的协议, 准备细胞裂解主混合 (WGA 试剂盒的组件、材料和试剂表)。简单地, 混合2.0 µL 的反应缓冲器, 1.3 µL octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 溶液), 1.3 µL 4-(11, 33-tetramethylbutyl) 苯基聚乙二醇 (10% 溶液), 2.6 µL 的蛋白酶 K 溶液, 12.8 µL RNase/DNase 无水获得主组合为10个样品 (总容量20µL)。注: 有关更多示例, 请相应地增加卷。细胞裂解主成分的组成不同于使用激光显微切割样品的替代程序 (见 5.2)。 使用油脂笔绘制一个区域, 保持细胞悬浮到位。如果单元格密度太高 (i. e), 请调整区域和音量. 在玻片上标记一个较大的区域, 载入 1x PBS 和细胞悬浮的整除)。 将整个染色细胞悬浮液吸管 (在步骤4.8 中获得) 放到玻璃滑梯上。 将玻璃滑梯转移到装有机器人的显微镜上。让单元格结算5分钟 (图 2D 和 2H)。 准备0.2 毫升的 PCR 管加载2.0 µL 细胞裂解主混合 (见步骤 5.1.1), 并储存在冰上。 使用机器人在1µL 的 1x PBS 中收集单细胞, 并将细胞转移到含有细胞裂解主混合物的管中。注: 用于将 micromanipulated 细胞转移到细胞裂解缓冲液中, 将毛细管直接放入溶解溶液的2µL 中, 然后弹出, 直至气泡可见。 在 2000 x g上简单地向下旋转3秒的样本, 使用桌面离心收集管道底部的所有液体。把样品放在冰上。 直接进行单单元格 WGA (参见6节和 Czyż et 。19)。 激光显微切割 (替代单细胞取样方法: 5.1。微操作系统)注意: 本节中使用的主混合组合与微操作系统5.1 节中使用的结构不同。单个细胞将被添加到4.5 µL 细胞裂解主混合 (WGA 试剂盒,材料和试剂表的组成部分) WGA。 根据 Czyż的et 等, 准备细胞裂解主组合。19通过混合5.0 µL 的反应缓冲器, 1.3 µL octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 溶液), 1.3 µL 4-(11, 33-tetramethylbutyl) 苯基聚乙二醇 (10% 溶液), µL 的蛋白酶 K 溶液, 2.6 µL RNase/DNase 水获得10样品 (总容积45µL) 的主混合。把主混在冰上。注: 有关更多示例, 请相应地增加卷。 紫外线处理膜涂层的幻灯片, 适合激光显微切割。因此, 将幻灯片放置在 DNA 交叉链接器设备中, 并将其暴露在最高紫外线下大约10分钟。 将膜涂层的幻灯片组装在 cytocentrifuge 中, 并将整个细胞悬浮在 300 x g上 cytospin 5 分钟。注: 当使用液中系统时, 将单元格 cytocentrifuged 到解决方案中的幻灯片上时, 请在 cytocentrifugation 后取出上清, 并在 1140 x g上应用干燥旋转1分钟。 直接进行激光显微切割或让 cytospins 空气干燥过夜, 并冻结-20 摄氏度的样品, 长期贮存。 吸管4.5 µL 细胞裂解大师混合到0.2 毫升 PCR 管的上限和收获单细胞通过激光显微切割。 从激光显微切割显微镜中提取 PCR 管, 并关闭管。通过短旋转收集管底部的所有液体, 并将样品放在冰上。 继续进行单细胞 WGA 或将隔离样品储存在-80 摄氏度, 在进一步加工前1月。 6. 基于适配器链接器的整个基因组放大18,19 注意: 确保所有必要的主混合 (WGA 套件的组件、材料和试剂表) 都准备就绪并存储在准备使用的冰上。主混合包括 dna 消化混合1为 micromanipulated (见 5.1) 样品 (含2.0 µL 反应缓冲器, 2.0 µL 的MseI 限制酶和16.0 µL RNase/DNase 无水) 或 DNA 消化混合2为激光显微切割 (见 5.2.)样品 (包含2.5 µL MseI 限制酵素和2.5 µL RNase/DNase 水), 预退火大师组合 (包含5.0 µL 反应缓冲器, 5.0 µL 每个 preannealing PCR 适配器和15.0 µL RNase/DNase 无水), 结扎主混合 (包含30.0 µL 预退火 PCR 适配器, 10.0 µL 腺苷磷酸溶液, 10.0 µL T4 连接酶溶液) 和初级 pcr 主混合 (含30.0 µL 的 pcr 缓冲, 20.0 µL 10 毫米核苷酸混合溶液, 10.0 µL 的聚合酶混合和340.0 µL 的 RNase/DNase 无水)。所有卷都提供准备10样品。相应地调整到样本数。 对于细胞裂解, 将 micromanipulated/激光显微切割样品放在热循环仪中, 并通过孵化细胞在42°c 为45分钟, 65 °c 30 分钟和80°c 进行单细胞裂解, 10 分钟。注: 使用加热盖子的热循环仪。细胞裂解可以做10到15小时的 O/N。在这种情况下, 省略孵化步骤在65摄氏度。 运行预退火的 PCR 适配器。因此, 在65摄氏度的热循环仪中孵化预退火主混合1分钟后再进一步49循环, 每1分钟, 随着温度逐渐降低1摄氏度/周期。在50个周期 (在15°c) 以后, 孵化大师混合在15°c 直到进一步用途。注意: 这一步是生成适合于结扎的非对称适配器 (参见步骤 6.6) 的必要步骤, 其中单细胞 DNA 受MseI 限制摘要的约束。 细胞裂解后, 将裂解样品在 2000 x g上旋转3秒以收集底部的所有液体, 并将其放在冰上。 为了片段 dna, 添加2µL 的 dna 消化混合1到每个裂解 micromanipulated 样本或0.5 µL 的 dna 消化混合2到激光显微切割样品和运行限制文摘。使用热循环仪的加热盖子在37°c 为5分钟, 其次是限制酶失活步骤65°c 5 分钟。注: 消化37摄氏度可延长至3h。这是唯一的协议步骤不同之间的样品从微操作系统和样品获得的激光显微切割。 向下旋转样品, 收集底部的所有液体, 放在冰上。 为结扎限制被消化的脱氧核糖核酸和预退火的适配器, 增加5.0 µL 结扎大师混合对每个被消化的脱氧核糖核酸样品并且结扎它在热量循环仪在15°c 为 1 h。注: 此步骤可扩展到 12 h 或执行 O/N。 向下旋转样品, 收集底部的所有液体, 放在冰上。 为 WGA 添加40.0 µL 的主要 PCR 主混合到每个结扎产品和运行 WGA 在热循环仪与加热盖子如下: 首先, 孵化的样品在68摄氏度3分钟。第二, 周期为15次, 在94°c 为四十年代, 57 °c 为三十年代和68°c 为1分钟三十年代 +1 s/周期。然后增加9个周期在94°c 为四十年代, 57 °c + 1 °c/周期为三十年代, 68 °c 为1分钟四十五年代 +1 s/周期。此后, 循环23倍于94°c 为四十年代, 65 °c 为三十年代, 68 °c 为1分钟五十三年代 +1 s/周期。最后, 在68摄氏度的3分钟内完成最后的延伸, 并将样品冷却到4摄氏度。 向下旋转样品, 收集底部的所有液体, 检查 DNA 质量, 或者将样品贮存在-20 摄氏度或-80 摄氏度, 用于长期贮存。 7. WGA 产品的质量控制 注: 在运行 4plex QC PCR 5后, 根据 DNA 涂片的范围和放大产品的数量检查 WGA 产品的质量。运行 WGA 整除数和各自的 QC-PCR 样品在1.0% 琼脂糖凝胶为评估。 准备用于4plex 质量控制 PCR (表 1) 的所有底漆的100µM 库存解决方案。添加8µL 的每一个底漆到136.0 µL 的 PCR 级水产生200µL 的底漆池。涡流解决方案为 3 s, 旋转它在 2000 x g为 3 s 和整除20µL 为存贮在-20 °c。 使用标准 pcr 试剂盒, 准备一个多重 pcr 组合, 包括6.0 µL 的 2x pcr 成分 (底漆除外), 4.5 µL 的 pcr 级水和0.5 µL 的底漆池。 添加1.0 µL 的 WGA 产品, 旋转下来, 并运行 PCR 在94摄氏度2分钟后35循环变性在94摄氏度为1分钟, 底漆退火在56°c 为1分钟和底漆延伸在72°c 为1分钟三十年代和最后的引伸步在72°c 为7分钟冷却它到4°c, 转动它并且放置样品在冰上为凝胶分析同一天或在-20 °c 为以后分析。注: 冷在热循环仪可以执行在12°c, 以增加寿命的珀尔的元素。 分析 WGA 产品 (从6.8 获得) 和各自的 4plex QC PCR 产品在琼脂糖凝胶5。