単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

すべてのプロシージャは、グラーツ医科大学 (12/13 ex 25-240) の倫理委員会によって承認されています。実験をスパイクの末梢血は、健康な人からサンプリングされました。 注: このプロトコルには、HT 29 細胞 (ひと大腸癌細胞株) PBS や HT 29 細胞と末梢血の人工混合物からの分離について説明します。同じ実験を 2 追加のセル行 (LNCaP と VCaP 代表結果に実験データ) と行い EpCAM を表現するすべてのセルで理論的に実行できます。 1. ターゲット細胞の調製 細胞培養と細胞のラベリング注: このプロトコルでセルを 75 cm ² 培養フラスコで培養しています。他の細胞培養装置を使用している場合、試薬の量を適宜調整してください(例: 25 cm ² 培養皿、6 ウェル プレート)。すべての液体は使用が 37 の ° C の水浴中で加温します。明示されていない、常温 (RT) プロトコルのすべての手順が実行されます。 1% ペニシリン/ストレプトマイシン 5% CO2の大気中の 37 ° C で 10% 牛胎児血清 (FBS)、20 mM Hepes 2 mM L グルタミンを添加したマッコイの 5 a 変更培地で培養 HT 29 細胞。 細胞が 90% の合流と、メディアを取り出して、10 ml の 1x PBS のセルをすすいでください。 細胞を収穫するには、セルに (テーブルの材料および試薬) 細胞剥離溶液 2 mL を追加し、37 ° C で約 5 分の細胞をインキュベート注: 剥離ソリューションに含まれるプロテアーゼや PBS、0.5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、および 3 mg/L フェノールレッド x 1 コラーゲン分解酵素。37 ° C で 1 時間後アクティブなこのことが細胞剥離液の前に地球温暖化の時間を最小限に抑える最適な細胞の剥離を取得する全体の細胞の層をカバーしてください。 倒立顕微鏡を用いた細胞の剥離を確認します。 (で使用した同じステップ 1.1.1。) 細胞培養培地 10 mL が充填された 50 mL のチューブにすべて剥離細胞を転送し、ピペッティングにより細胞を再懸濁します。 RT で水平ローラー ミキサーの残りの細胞懸濁液を置き、ラベリングの手順に進みます。 細胞は、標的細胞のラベリングをライブします。 5 mm CFSE (ジメチルスルホキシド、DMSO 中付属) 1 mL の 1x PBS で 1 μ L 希釈は 5 μ M に使える CFSE ラベル ソリューションを取得する 37 ° C で加温。注: 最適な染色結果を得るのため、作りたてのソリューションを使用します。 準備準備ができて使用する DNA 染色ソリューション (テーブルの材料および試薬) 1x PBS で、光から保護 2-6 ° C で保存します。注: 最適な染色結果を得るのため、作りたてのソリューションを使用します。 300 x gで 10 分間のセルを削除する水平ローラー ミキサー (ステップ 1.1.6。) からの細胞とペレット上清を取得し、10 mL の 1x PBS で細胞を再懸濁します。 1x PBS で再びセルを洗浄し、500 μ L に使える CFSE ラベリング ソリューションで細胞ペレットを再懸濁します。 37 ° C 15 分で細胞をインキュベートし、3 分間 300 × gで遠心分離後セルを収集します。 30 分の 37 ° C で再生成する細胞ができ、予め温めておいた細胞培養液の 1 mL の細胞を再懸濁します。 3 分間 300 × gで遠心分離によって細胞を収穫し、染色液を 37 ° C, 10 分で準備ができて使用する DNA の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。 細胞のペレット、上澄みを除去し、4 mL の 1x PBS で細胞を再懸濁します。診断細胞密度を評価し、装備蛍光ラベリング蛍光顕微鏡を用いた 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) とかに (FITC) フィルター (図 2 a と 2 e) をチェックします。 300 x g 3 分で細胞を遠心し、次のセクションと氷の場所で与えられたそれぞれの実験に必要な細胞の密度によると細胞ペレットを再懸濁します。 2. ワイヤーの充電 注: セルはターゲット セル/末梢血液 spikings ミリリットル スケールまたは低 1 マイクロリットル スケールで細胞数を提供することによってから分離できます。一方前者のアプローチは、末梢血で珍しいセルの条件を模倣するためことができます、後者がありますプロトコル最適化/テストの目的のための少数のセルを接続する方法。 大量の細胞懸濁液を使用してワイヤを充電 40 mL の 1x PBS (携帯文化使用) に BSA の 0.8 g を溶解することにより解決を妨げる 2 %bsa を準備します。初期ボルテックスし、10 〜 20 分の水平ローラー ミキサーに RT でその後インキュベーション BSA を溶解します。 リンス空 EDTA 管/ナトリウム ヘパリン チューブ 2 mL 2 %bsa を抗凝固剤の残基を削除し、ソリューションを破棄します。15 rpm で 30 分間の水平ローラー ミキサーに 2 %bsa の 5 mL 常温培養で管表面をブロック、溶液を廃棄します。 ラベル付きセル (セクション 1.2) 100 000 細胞/ml の密度を希釈し、5 mL を使用して、ワイヤを充電します。 チューブに標識細胞懸濁液 (合計 500 000 セル) 5 mL を追加します。細胞懸濁液を追加するときは、泡を避けるため。 収納スペースだけでなく、ワイヤーを保持しているゴム製のキャップから線を削除、1 × PBS (図 3) でそれをすすいでください。 注射針 (20 G) の助けを借りて、EDTA 管 (ステップ 2.1.4。) のゴム管キャップを貫通し、キャップ チューブとチューブの背面に配置する場合傾斜ローラー ミキサー一部の機能は細胞懸濁液に完全に浸漬するようワイヤーを挿入します。注: ワイヤの三重らせん機能部分は充電中で細胞を懸濁液でカバーされなければなりません。 セルが線をアタッチするように 30 分間 5 rpm で傾斜ローラー ミキサーにチューブを回転させます。 5 mL の 1x PBS でワイヤーを洗い、目視検査まで 15 mL 管内 1x PBS で 2-6 ° C で暗闇の中で保存します。注: 線の一部の機能は、細胞を傷つけることを避けるために PBS で常に水没する必要があります。 末梢血と人工の混合物から標的細胞を分離する (代替充電方法: 2.1。大量の細胞懸濁液を使用してワイヤを充電) 細胞密度の高い細胞懸濁液を取得するラベル付きセル (セクション 1.2) を希釈 (> 1 000 000 細胞/ml)、それにより細胞懸濁液、末梢血に追加のボリュームを低く保ちます。 末梢血 5 mL に乃至 500 セルを追加し、チューブの反転によってそれらをミックスします。 収納スペースから線を削除、ワイヤーを保持しているゴム製のキャップを削除および 1x PBS で洗浄します。 機能部分はキャップは管と管の背面に置かれたとき傾斜ローラー ミキサー スパイクの血に没頭するように注射器の針 (20 G) を使用して、デバイスの非機能的な部分で新しいチューブ キャップを貫通します。注: ワイヤの三重らせん機能部分は充電中で細胞を懸濁液でカバーされなければなりません。 室温 30 分間 5 rpm で傾斜ローラー ミキサーにチューブを孵化させなさい 1x PBS でワイヤーを 3 回洗浄、目視検査まで 1x PBS を含む 15 mL チューブに暗闇の中で保存できます。注: 線の一部の機能は、細胞を傷つけることを避けるために常に水没する必要があります。 少量の細胞懸濁液からワイヤーを充電 (充電方法の代替: 2.1。大量の細胞懸濁液を使用してワイヤを充電) 1 000 000 細胞/mL の 1x PBS で細胞を再懸濁します。 ラックに 150 ミリメートル使い捨てガラス パスツール ピペットを水平に修正します。 収納部からワイヤーを削除が、ワイヤーを保持している黄色のゴム製のキャップをしてください。 官能部分がガラスに触れないように Pasteur のピペットの先端に位置していますようにピペットでワイヤを配置します。注: ワイヤーの先端はパスツール ピペット チップから守らなければなりません。ワイヤーを保持しているゴム製のキャップをパスツール ピペット チップの後部を接続しないでください。しっかり接続されている、細胞懸濁液はピペット チップに反対側から読み込むことができません。 ワイヤの機能性の一部を覆うパスツール ピペットの先端に細胞懸濁液の 15 μ L をロードします。 10 分手動で 90 度回転用のワイヤーは毎分組み立てワイヤー/パスツール ピペット チップ インキュベートします。 パスツール ピペット先端から線を削除、5 mL の 1x PBS で洗浄、目視検査まで 15 mL 管内 1x PBS で 2-6 ° C で暗闇の中で保存します。メモ: 一部の機能は、細胞を傷つけることを避けるために 1 × PBS で常に水没する必要があります。 3. ワイヤ上のセルを数える 注: 常に、細胞を傷つけることを避けるために 1x PBS で冠水した線の機能の一部です。 ガラス スライドに四角形の領域を描画し、1 × PBS を 500 μ l 添加グリース ペンを使用します。 ワイヤーの非機能的な部分を曲げるし、1 × PBS に没頭して、一部の機能、スライド ガラスの上に置きます。注: フィット 1x PBS ワイヤの一部の機能を完全にカバーするための四角形の面積および体積。スライドにワイヤーの非機能の一部をマウントするのにには、両面粘着テープを使用します。 キャプチャした細胞 (図 2 b と 2 階) を列挙するワイヤーの両側を目視で確認します。注: 細胞の存在は、DAPI の FITC フィルターを搭載した蛍光顕微鏡を使用して決定されます。ワイヤーの両側を検査し、細胞数が (高い細胞数) を評価またはカウント (細胞の低い数字は、ワイヤに接続されている場合のみ可能)。セルの列挙が必要ない場合、この手順をスキップできます。 スキャンした後、1 × PBS を含む 15 の mL の管にワイヤを配置 (2.3.6 の注を参照してください。 セクション 3。)、暗闇の中でワイヤーを格納。注: ワイヤーの非機能的な部分のほとんどは (曲げを含む) をカットすることができます、緩和ストレージを削除します。 4. 剥離と標的細胞の回復 注: 細胞の剥離は 4 h 以内分離後行うものとします。 1x PBS の mL あたりリリース バッファー コンポーネント (テーブルの材料および試薬) 4 mg を溶解し、0.2 μ m の滅菌フィルターをすぐに使用できるバッファーを取得するを介してソリューションをフィルターします。注: ワイヤーのポリマーは、EpCAM 提示ターゲット細胞へのバインドを許可するアンチ EpCAM 抗体修飾とは、ゲルで構成されます。リリースのバッファーには、ヒドロゲルを割断できる炭素-酸素タンパク分解酵素が含まれています。蛋白質分解開裂は、ポリマーの劣化と、したがって、キャプチャされた細胞の剥離の結果します。 前 5 分の 37 ° C でリリース バッファーを温めます。 1.6 mL の 1.5 mL の反応管に合わせてリリース バッファーを追加します。注: チューブ 1.5 mL 反応ボリューム用に設計された 1.6 ml 水没ワイヤの一部の機能に必要なアプリケーションができます。 20 分は、風呂の水で培養時の汚染を避けるために 1.5 mL チューブにワイヤーを固定するチューブ キャップの代わりにワイヤーを付属のゴムキャップを使用は、37 ° c (水浴) リリース バッファー ワイヤの一部の機能を孵化させなさい。 ワイヤー ・ チューブ アセンブリを RT と 500 rpm で 15 分間のシェーカーに転送します。注: シェーカーは、1.5 mm の軌道です。 遠心分離機のワイヤー/チューブ アセンブリを置き、300 × g 10 分間でスピンします。 チューブから線を削除、キャップを閉めて、300 × g 10 分間でもう一度チューブを遠心分離します。注: ワイヤーは 2 〜 6 ° C で 1 × PBS で剥離効率/チェック ワイヤで残りのセルを評価するセルをカウントするため暗闇の中で格納できます。 細胞懸濁液の量を減らすためには、100 μ (マイクロ)、または上澄みの代わりに 300 μ L (cytocentrifugation およびその後のレーザー顕微解剖) を削除し、すぐに単一セルのサンプリングに進みます。 5. 単一セル サンプリング マイクロマニピュレーション注: セル換散マスター ミックスできる WGA の 2 μ L に単一セルが加わります。処理は、ピペッティングおよび場所のセル換散のマスターの組合せ氷の上による損失のための余分なボリュームを計算するセルの数によるとマスター ミックスを準備します。 Czyżら18で概説されたプロトコルに従ってセル換散マスター ミックス (WGA キット、材料テーブルおよび試薬のコンポーネント) を準備します。簡単に言えば、2.0 μ L の反応バッファー、octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 溶液) の 1.3 μ L、4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) の 1.3 μ L をミックス フェニル – ポリエチレング リコール (10% 溶液)、プロテイナーゼ K 溶液の 2.6 μ L と 12.8 μ L を取得する水の RNase/DNase 自由、10 個のサンプル (容量 20 μ L) のためのマスターの組合せ。注: より多くのサンプルのために、ボリュームをそれに応じて増やします。セル換散のマスター ミックスの組成 (5.2 を参照)。 レーザー顕微解剖サンプルを活用した代替の手順で使用されるものとは異なります。 グリース ペンを使用して、場所に細胞懸濁液を保持領域を描きます。細胞密度が高すぎる場合、領域およびボリュームを調整 (すなわち。 スライド ガラスに大きな領域をマークすると、1 × PBS そして細胞懸濁液の因数を読み込む)。 ピペットのスライド ガラスの上に全体のステンド グラス セル中断 (4.8 のステップで取得)。 マイクロマニピュレーターを搭載した顕微鏡スライド ガラスに転送します。セル 5 分 (図 2 D 、2 H) のために解決しなさい 0.2 mL PCR チューブのセル換散マスター 2.0 μ L を搭載 (5.1.1 の手順を参照してください)。 をミックスし、氷の上保存を準備します。 1 μ L のマニピュレーターを使用して 1 × PBS で単一細胞を収集し、セル換散のマスターの組合せを含んでいる管にセルを転送します。注: セル換散バッファーに micromanipulated セルを転送するためには、溶解溶液 2 μ L キャピラリーを直接に、泡を見ることができるまでを取り出します。 2000 x g 3 のサンプルを簡単にスピン s デスクトップおよび microfuge を使用して管の下部にすべての液体を収集します。氷の上にサンプルを配置します。 単一セルの WGA に直接進む (セクション 6 を参照してくださいと Czyżら。19)。 レーザーマイクロダイ セクション (代替の単一細胞採取方法として: 5.1。マイクロマニピュレーション)注: このセクションで使用されるマスター ミックスの組成マイクロマニピュレーション用セクション 5.1 で使用されるものとは異なります。単一のセルは、WGA のセル換散のマスターの組合せ (WGA キット、材料テーブルおよび試薬のコンポーネント) の 4.5 μ L に追加が。 Czyżらによるとセル換散のマスター ミックスを調製します。1.3 μ 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)、octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 溶液) の 1.3 μ L 反応バッファーの 5.0 μ L を混合することによって19フェニル – ポリエチレング リコール (10% 溶液)、それぞれ、プロテイナーゼ K 溶液の 2.6 μ L、RNase の 34.8 μ L/10 個のサンプル (総容積 45 μ L) のマスター ミックスを取得する DNase 自由な水。氷の上のマスターの組合せの場所。注: より多くのサンプルのために、ボリュームをそれに応じて増やします。 UV 治療膜コーティング スライドは、レーザ切断に適しています。したがって、リンカー デバイス クロス DNA にスライドを配置し、約 10 分のための最高の紫外線に公開します。 収集と cytospin 300 x gで 5 分で全体の細胞懸濁液の膜コーティング スライドを組み立てます。注: セルがソリューションでは、スライド上に cytocentrifuged 液中システムを使用して、cytocentrifugation 後、上清を除去、1140 × gで 1 分でドライ スピンを適用されます。 レーザーマイクロダイ セクションまたは一晩風乾、凍結、長期的な保存のための-20 ° C で cytospins に直接進みます。 0.2 mL PCR チューブのキャップにセル換散のマスター ミックスの 4.5 μ L をピペット、レーザ切断による単一細胞を収穫します。 レーザー顕微解剖顕微鏡から PCR チューブを取得し、チューブを閉じます。ショート スピン チューブの下部にすべての液体を収集し、氷の上、サンプルを配置します。 単一セルの WGA を続行またはさらに処理する前に 1 ヶ月-80 ° C で分離のサンプルを格納します。 6. アダプター リンカーによる全ゲノム増幅18,19 注: すべての必要なマスター ミックス (WGA キット、材料テーブルおよび試薬のコンポーネント) が調製し、氷を使用する準備ができてに格納されていることを確認します。マスターのミックスは、micromanipulated の DNA 消化ミックス 1 (5.1 を参照). サンプル (2.0 μ L 反応バッファーのMseの 2.0 μ L を含む私制限の酵素そして RNase/DNase 自由水の 16.0 μ L) または DNA 消化ミックス レーザー顕微解剖用 2 (5.2 を参照)。サンプル ( Mseの 2.5 μ L を含む私制限の酵素そして RNase/DNase 自由水の 2.5 μ L)、熱処理済みマスター ミックス (反作用バッファーの 5.0 μ L、preannealing PCR アダプターのそれぞれの 5.0 μ L と RNase/DNase 自由水の 15.0 μ L 含む)、結紮術マスター ミックス (仮焼成を PCR アダプター、10.0 μ L のアデノシン三リン酸のソリューション、および 10.0 μ L T4 リガーゼ ソリューションの 30.0 μ L を含む) と主な PCR マスター ミックス (PCR バッファー、20.0 μ 10 mM deoxynucleotide ミックス ソリューション、ポリメラーゼの 10.0 μ L の含む 30.0 μ Lミックスと RNase/DNase 自由水の 340.0 μ L)。すべてのボリュームは、10 個のサンプルを準備するため与えられています。それに応じて調整するサンプルの数。 セル換散のためサーマルサイクラーに micromanipulated/レーザー顕微解剖サンプルを配置し、65 ° C で 30 分間、80 ° C, 10 分の 45 分間の 42 ° C で細胞を培養して単一セル換散を実行します。注: は、温水のふた付きサーマルサイクラーを使用します。セル換散は 10 に 15 h の O/N を行うことができます。その場合、65 ° c. で孵化手順を省略します。 事前アニーリング PCR アダプターの実行します。したがって、さらに 49 サイクル、1 分ごとに、続く 1 分の 65 ° C で熱 cycler で焼鈍前のマスターの組合せをインキュベート徐々 に 1 ° c 温度の低下とともに/サイクルします。(15 ° C) で 50 サイクル後さらに使用するまで 15 の ° c のマスターの組合せを孵化させなさい。注: この手順は非対称アダプター結紮に適して生成に必要な (ステップ 6.6 を参照してください). 単一細胞の DNA とを受けるMse私制限のダイジェスト。 3 2000 x gで分離サンプル スピンダウン セル換散後 s を下部にすべての液体を収集し、氷の上に置きます。 DNA を断片化するには、各分離 micromanipulated サンプルに 2 μ L の DNA 消化ミックス 1 を追加または 0.5 μ L の DNA 消化レーザー顕微解剖サンプル 2 をミックスし、制限のダイジェストを実行します。37 ° C で加熱されたふた付け 5 分間続き、65 ° c 5 分制限の酵素不活性化ステップのサーマルサイクラーを使用します。注: 37 ° C で消化が 3 h に延長されます。これはマイクロマニピュレーションから得られたサンプルとレーザー顕微解剖から得られた試料の異なるプロトコル手順のみです。 スピン ・ ダウン下部のすべての液体を収集し、氷の上のサンプル。 結紮術マスターの 5.0 μ L を追加制限消化 DNA および仮焼成をアダプターを縛ることの各消化の DNA サンプルを混合し、1 h 15 ° C で熱 cycler で縛る。注: この手順 12 h に拡張することができますまたは O/n. を実行 スピン ・ ダウン下部のすべての液体を収集し、氷の上のサンプル。 WGA の結紮製品のそれぞれに主な PCR マスター ミックスの 40.0 μ L を追加次: 最初として温水ふた付きサーマルサイクラーで WGA を実行、68 ° C、3 分でサンプルをインキュベートします。40 94 ° C で 15 回のサイクルの第二に、s、57 ° C、30 秒、1 分 30 の +1 秒/サイクルの 68 の ° C。40 94 ° C で 9 サイクルを追加 s、57 + 1 ° C 30 サイクル/秒、1 分 45 の +1 秒/サイクル 68 ° C。その後、23 回 40 94 ° C でのサイクル s、65 ° C、30 s、68 ° C、1 分 53 の +1 秒/サイクル。最後に、3 分 40 秒の 68 ° C で最終的な拡張を実行し、4 ° C にサンプルを冷やす 下部のすべての液体を収集および DNA の品質をチェックまたは-20 ° C または長期保存用-80 ° C でサンプルを格納するサンプルをスピンダウンします。 7. WGA 製品の品質の管理 注: 4 plex QC PCR 5を実行した後 DNA スミアと増幅製品数の範囲に基づいて WGA 製品の品質を確認してください。評価の 1.0% の agarose のゲルに WGA 因数とそれぞれ QC PCR サンプルを実行します。 4 plex 品質コントロール PCR (表 1) に使用されるすべてのプライマーの 100 μ M 溶液を準備します。136.0 μ L の PCR 用プライマー プール 200 μ L を生成する水にすべてのプライマーの 8 μ L を追加します。渦 3 ソリューション s、3 s と因数 20 μ-20 ° C で保存用の 2000 x gでスピンダウン マルチプレックス PCR マスターを準備する使用標準 PCR キット含む 6.0 μ (プライマー) を除く 2 x PCR コンポーネント、PCR グレード水 4.5 μ およびプライマー プールの 0.5 μ L を混ぜます。 WGA 物 1.0 μ L を追加、それをスピンダウン、94 ° C、2 分で実行 PCR 後変性 94 ° C で 1 分、プライマーアニー リングの 56 ° C、1 分と 1 分 30 秒 72 ° C でプライマー拡張で最終的な拡張ステップの 35 サイクル4 ° C にそれを冷やす 72 ° c で 7 分間、それをスピンダウンし、同日のゲルの分析や後の分析のための-20 ° C で氷の上サンプルを配置します。注: 熱 cycler の低温は、熱電変換素子の寿命を増加する 12 の ° C で実行できます。 (6.8 から取得) WGA 製品および agarose ゲル5にそれぞれ 4 plex QC PCR の製品を分析します。