Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

Toutes les méthodes qui ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Graz (25-240 ex 12/13). Sang périphérique pour expériences de fortification a été échantillonné par des individus en bonne santé. Remarque : Ce protocole décrit l’isolement des cellules HT-29 (lignée humaine de cellule de cancer du côlon) de PBS ou de mélanges artificiels des cellules HT-29 et le sang périphérique. La même expérience a été réalisée avec deux lignées de cellules supplémentaires (LNCaP et VCaP, données expérimentales dans les résultats de représentant) et peut théoriquement être effectuée avec toutes les cellules exprimant EpCAM. 1. préparation des cellules cibles Culture cellulaire et l’étiquetage des cellulesRemarque : Dans le présent protocole, les cellules sont cultivées dans des flacons de culture 75 cm². S’il vous plaît ajuster les quantités de réactifs en conséquence si les autres appareils de culture cellulaire sont utilisés (par exemple les récipients de culture de 25 cm², plaques 6 puits, etc..). Tous les liquides utilisés sont préchauffées à 37 ° C dans un bain d’eau. Indication contraire, toutes les étapes de protocole sont effectuées à température ambiante (RT). Cellules HT-29 de culture dans un milieu de McCoy 5 a modifié additionné de 2 mM de L-glutamine, 20 mM Hepes, 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine à 37 ° C en atmosphère 5 % CO2 . Lorsque les cellules sont 90 % anastomosé, enlever le milieu et rincer les cellules avec 10 mL de PBS 1 x. Pour récolter les cellules, ajouter 2 mL de la solution de détachement cellulaire (Table des matières et réactifs) aux cellules et incuber les cellules pendant environ 5 min à 37 ° C.Remarque : La solution de détachement contient protéolytique et enzymes collagénolytique dans 1 x PBS, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 0,5 mM et 3 mg/L rouge de phénol. Réduire le temps de préchauffage de la solution de détachement cellulaire au minimum, il vous sera inactif après 1 h à 37 ° C. Recouvrir la couche de cellules entières pour obtenir le détachement cellulaire optimal. Vérifier le détachement des cellules à l’aide d’un microscope inversé. Transférer tout détaché de cellules dans un tube de 50 mL remplie au préalable avec 10 mL de milieu de culture cellulaire (même que celui utilisé à l’étape 1.1.1.) et remettre en suspension les cellules de pipetage. Placez la suspension de cellules restantes sur un mélangeur à rouleaux horizontaux à ta et passez à l’étape d’étiquetage. Vivre la cellule étiquetage des cellules cibles Diluer 1 µL de 5 mM CFSE (fourni dans le diméthylsulfoxyde, DMSO) dans 1 mL de PBS 1 x préchauffée à 37 ° C pour obtenir la solution d’étiquetage 5µm prêt-à-utiliser CFSE.Remarque : Pour des résultats optimaux de coloration, utiliser des solutions fraîchement préparées. Préparer une solution de coloration à la DNA, prêt à l’emploi (Table des matières et réactifs) en dans du PBS 1 x et stockez-le à 2-6 ° C, abri de la lumière.Remarque : Pour des résultats optimaux de coloration, utiliser des solutions fraîchement préparées. Obtenir les cellules de table de mixage rouleau horizontal (étape 1.1.6.) et pellet que les cellules à 300 g pendant 10 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de PBS 1 x. Rincer les cellules encore une fois avec du PBS 1 x et Resuspendre le culot dans la solution d’étiquetage CFSE 500 µL prêt-à-utiliser. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 15 min et de recueillir les cellules après centrifugation à 300 g pendant 3 min. Remettre en suspension les cellules marquées dans 1 mL de milieu de culture cellulaire pré chauffé et laisser les cellules à se régénérer à 37 ° C pendant 30 min. Récolter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 3 min et remettre en suspension les granules cellulaires dans 1 mL de l’ADN de prêt-à-utiliser la coloration de la solution à 37 ° C pendant 10 min. Les cellules de granule, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 4 mL de PBS 1 x. Évaluer la densité des cellules à l’aide d’un hémocytomètre et vérifier pour fluorescence étiquetage à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé avec 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’isothiocyanate de fluorescéine filtres (FITC) (Figure 2 a et 2E). Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min et Resuspendre le culot cellulaire selon la densité des cellules nécessaires à l’expérience respective, tel qu’il figure dans la section suivante et le lieu sur la glace. 2. le fil de charge Remarque : Les cellules peuvent être isolées de la cible cellulaire/périphérique sang spikings à l’échelle de millilitre ou en fournissant le faible nombre de cellules à l’échelle microlitre. Alors que la première approche permet pour imiter les condition de rares cellules dans le sang périphérique, celui-ci peut être préférable de fixer quelques cellules aux fins d’optimisation de protocole/essais. Le fil à l’aide d’un grand volume des suspensions de cellules de charge Préparer un 2 % de BSA bloquant la solution en dissolvant 0.8 g de BSA dans 40 mL de PBS 1 x (utilisation de culture cellulaire). Dissoudre BSA par Vortex initial et subséquente d’incubation à ta sur un mélangeur à rouleaux horizontaux pour 10-20 min. Rinçage vides tubes/sodium héparine tubes EDTA avec 2 mL de 2 % de BSA pour enlever les résidus anticoagulant et jetez la solution. Bloquer la surface du tube en incubation à RT avec 5 mL de 2 % de BSA sur un mélangeur à rouleaux horizontaux à 15 tr/min pendant 30 min et jetez la solution. Diluer les cellules marquées (section 1.2) pour une densité de 100 000 cellules/mL et 5 mL permet de recharger le fil. Ajouter 5 mL de la suspension de cellules marquées (de 500 000 cellules au total) dans le tube. Éviter les bulles lors de l’ajout de la suspension cellulaire. Retirer le câble de l’espace de rangement ainsi que le capuchon en caoutchouc tenant le fil et le rincer dans du PBS 1 x (Figure 3). Pénétrer le capuchon du tube en caoutchouc du tube EDTA (étape 2.1.4.) à l’aide d’une aiguille de seringue (20G) et insérez le fil de sorte que la partie fonctionnelle est complètement immergée dans la suspension cellulaire lorsque le bouchon est sur le tube et le tube placé sur la table de mixage Rouleau incliné.Remarque : La triple hélice partie fonctionnelle du fil doit être recouvert de suspension cellulaire tout au long de la charge. Faire pivoter les tubes sur une table de mixage Rouleau incliné à 5 tr/min pendant 30 min permettre les cellules à attacher au câble. Rincez le fil avec du PBS 1 x 5 mL et placez-le dans l’obscurité entre 2 et 6 ° C dans un tube de 15 mL contenant 1 x PBS jusqu’à un examen visuel.NOTE : La partie fonctionnelle du fil doit toujours être immergée dans du PBS pour éviter d’endommager les cellules. Isoler les cellules cibles de mélanges artificiels avec du sang périphérique (variante charge méthode pour : 2.1. Le fil à l’aide d’un grand volume des suspensions de cellules de charge) Diluer les cellules marquées (section 1.2) pour obtenir des suspensions cellulaires à haute densité cellulaire (> 1 000 000 cellules/mL), ce qui maintenant le volume de suspension cellulaire ajouté à du sang périphérique bas. Ajouter 500 à 500 000 cellules à 5 mL de sang périphérique et les mélanger en retournant le tube. Retirer le câble de l’espace de rangement, enlever le capuchon en caoutchouc tenant le fil et le rincer dans du PBS 1 x. Pénétrer un nouveau capuchon du tube avec la partie non fonctionnelle de l’appareil à l’aide d’une aiguille de seringue (20G) tel que la partie fonctionnelle est complètement immergée dans le sang enrichi lorsque le bouchon est sur le tube et le tube placé sur la table de mixage Rouleau incliné.Remarque : La triple hélice partie fonctionnelle du fil doit être recouvert de suspension cellulaire tout au long de la charge. Incuber le tube sur le mélangeur Rouleau incliné à 5 tr/min pendant 30 min à température ambiante. Rincez le fil 3 fois dans du PBS 1 x et stockez-la dans le noir dans un tube de 15 mL contenant 1 x PBS jusqu’à un examen visuel.Remarque : La partie fonctionnelle du fil doit toujours être immergée pour éviter d’endommager les cellules. Le fil de suspensions cellulaires de faible volume de charge (variante charge méthode pour : 2.1. Le fil à l’aide d’un grand volume des suspensions de cellules de charge) Remettre en suspension les cellules marquées à 1 000 000 cellules/mL dans une solution 1 PBS x. Fixer un 150 mm jetable pipette Pasteur en verre horizontalement sur une grille. Retirer le câble de l’espace de rangement, mais garder le bouchon jaune tenant le fil. Placez le fil dans la pipette de telle sorte que la partie fonctionnalisée est située à l’extrémité de la pipette Pasteur sans toucher le verre.Remarque : L’extrémité du fil ne devrait pas s’en tenir sur la pointe de pipette Pasteur. Évitez de brancher l’extrémité arrière de la pointe de pipette Pasteur avec le capuchon en caoutchouc tenant le fil. Collés serrés, des suspensions cellulaires ne peut pas être chargées de l’autre côté dans l’embout de la pipette. Charger 15 µL de la suspension cellulaire dans l’embout de la pipette Pasteur couvrant la partie fonctionnalisée du fil. Incuber le fil pendant environ 10 minutes manuellement quart de tour la pipette assemblés fil/Pasteur chaque minute. Retirer le câble de l’embout de la pipette Pasteur, rincez-la dans 5 mL de PBS 1 x et placez-le dans l’obscurité entre 2 et 6 ° C dans un tube de 15 mL contenant 1 x PBS jusqu’à un examen visuel.Remarque : La partie fonctionnelle doit toujours être immergée dans du PBS 1 x pour éviter d’endommager les cellules. 3. comptage de cellules sur le fil NOTE : Toujours garder la partie fonctionnelle du fil immergé dans la solution de 1 PBS x pour éviter d’endommager les cellules. Utiliser un stylo de graisse pour dessiner une zone rectangle sur une lame de verre et ajouter 500 µL de PBS 1 x. Plier la partie non fonctionnelle du fil et placez-le sur la lame de verre telles que la partie fonctionnelle est plongée dans du PBS 1 x.Nota : Placer la surface du rectangle et le volume de solution de 1 PBS x pour couvrir complètement la partie fonctionnelle du fil. Utilisez un ruban adhésif double-face pour monter la partie non fonctionnelle du fil sur la diapositive. Inspecter visuellement les deux côtés du fil pour énumérer les cellules capturées (Figure 2 b et 2F).Remarque : La présence de cellules est déterminée à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI et FITC. Les deux côtés du fil peuvent être inspectées et le nombre de cellules soit évaluée (pour les numéros de cellulaire élevée) ou comptés (uniquement possible si faible nombre de cellules est relié au câble). Cette étape peut être sautée si le dénombrement des cellules n’est pas nécessaire. Après la numérisation, placez le fil dans le tube de 15 mL contenant la solution de PBS 1 x (voir Note du 2.3.6. et l’article 3.), stocker le fil dans l’obscurité.Remarque : La plupart de la partie non fonctionnelle du fil peut être coupé (y compris le coude) et enlevé stockage accélération. 4. détachement et la récupération des cellules cibles NOTE : Détachement des cellules se fera moins de 4 h après l’isolement. Dissoudre 4 mg de la composante de mémoire tampon de sortie (Table des matières et réactifs) par mL de solution 1 PBS x et filtrer la solution sur un filtre stérile de 0,2 µm pour obtenir le tampon prêt à l’emploi.Remarque : Le polymère du fil est composé d’un hydrogel qui est fonctionnalisé avec des anticorps anti-EpCAM permettant la fixation aux cellules cibles présentant EpCAM. Le tampon de sortie contient une enzyme protéolytique de carbone-oxygène capable de cliver l’hydrogel. Le clivage protéolytique entraîne la dégradation du polymère et, par conséquent, détachement des cellules capturées. Réchauffez le tampon de sortie à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 1,6 mL de tampon de sortie pour remplir un tube de réaction de 1,5 mL.NOTE : Les Tubes conçus pour la réaction de 1,5 mL volumes permettent demande de 1,6 mL, ce qui est nécessaire pour immerger la partie fonctionnelle du fil. Incuber la partie fonctionnelle du fil dans le tampon de sortie à 37 ° C (bain d’eau) pendant 20 min. utiliser le capuchon en caoutchouc livré avec le fil plutôt que le capuchon du tube pour fixer le fil dans le tube de 1,5 mL pour éviter toute contamination pendant l’incubation dans le bain d’eau. Transférer l’assemblage câble/tuyau à un agitateur à RT et 500 tr/min pendant 15 min.Remarque : Le shaker a une orbite de 1,5 mm. Placez l’assemblage câble/tuyau dans une centrifugeuse et le tourner à 300 x g pendant 10 min. Retirer le fil du tube, fermer le couvercle et centrifuger le tube à nouveau à 300 x g pendant 10 min.Remarque : Le fil peut être stocké dans du PBS 1 x 2-6 ° c dans le noir pour le comptage des cellules afin d’évaluer l’efficacité de détachement/chèque pour les cellules restantes sur le fil. Pour réduire le volume de la suspension cellulaire, supprimer tous sauf 100 µL (micromanipulation) ou alternativement 300 µL (cytocentrifugation et microdissection laser ultérieure) du liquide surnageant et immédiatement procéder à un échantillonnage unicellulaires. 5. cellule unique échantillonnage MicromanipulationNOTE : Cellules individuelles s’ajouteront à 2 µL du mélange maître de cellule lysis permettant de WGA. Préparer le mélange maître selon le nombre de cellules traitées, de calculer des volumes supplémentaires de perte en raison de pipetage et lieu cell lyse mélange principal sur la glace. Préparer la cellule lysis master mix (composants du kit WGA, Table des matières et réactifs) selon le protocole décrit par Czyż et al.18. Mélanger brièvement, 2,0 µL de tampon de réaction, 1,3 µL d’octylphenoxypolyethoxyethanol (solution à 10 %), 1,3 µL de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène-glycol (solution à 10 %), 2,6 µL d’une solution de protéinase K et 12,8 µL eau exempte de RNase/DNase pour obtenir un mix Master pour 10 échantillons (volume total 20 µL).Remarque : Pour plus d’échantillons, augmenter les volumes en conséquence. La composition du mélange principal de lyse cellulaire diffère de celle utilisée dans la procédure alternative utilisant des échantillons de microdissection laser (voir 5.2.). Utilisez un stylo de graisse pour dessiner une zone maintenant la suspension cellulaire en place. Ajuster la surface et volume si la densité cellulaire est trop élevée (i.e. marquer une zone plus vaste sur la lame de verre, 1 x PBS et une partie aliquote de la suspension de cellules de charge). Pipetter, la suspension de toute cellule tachée (obtenue à l’étape 4.8.) sur la lame de verre. Transférer la lame de verre à un microscope équipé d’un micromanipulateur. Laisser les cellules à se contenter de 5 min (Figure 2D et 2 H). Préparer 0,2 mL PCR tubes chargés avec 2,0 µL du maître de la lyse cellulaire mélangent (Voir l’étape 5.1.1) et placez-le sur la glace. Recueillir des cellules individuelles en 1 µL de PBS 1 x en utilisant le micromanipulateur et transférer les cellules dans un tube contenant le mélange maître de lyse cellulaire.Remarque : Pour le transfert de cellules micromanipulés dans le tampon de lyse cellulaire Placez le capillaire directement dans les 2 µL de solution de lyse et éjecter jusqu’à ce que les bulles sont visibles. Faites tourner brièvement vers le bas de l’échantillon à 2000 x g pendant 3 s en utilisant un bureau microtubes pour recueillir tout le liquide au fond du tube. Placer les échantillons sur la glace. Passez directement à l’unicellulaire WGA (voir la section 6. et Czyż et al. ( 19). Microdissection de laser (méthode de rechange unicellulaire d’échantillonnage à : 5.1. Micromanipulation)Remarque : La composition du mélange maître utilisée dans cette section diffère de celle utilisée dans la section 5.1 pour micromanipulation. Cellules individuelles s’ajouteront à 4,5 µL du mélange principal (composants du kit WGA, Table des matières et réactifs) de lyse cellulaire pour WGA. Préparer le mélange maître de lyse cellulaire selon Czyż et al. 19 en mélangeant 5,0 µL de tampon de réaction, 1,3 µL d’octylphenoxypolyethoxyethanol (solution à 10 %), 1,3 µL de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène-glycol (solution à 10 %), respectivement, 2,6 µL d’une solution de protéinase K et 34,8 µL de RNase / Eau exempte de DNase pour obtenir un mélange maître pour 10 échantillons (volume total 45 µL). Placez le mélange maître sur la glace.Remarque : Pour plus d’échantillons, augmenter les volumes en conséquence. UV-régal revêtement membrane diapositives adapté à la microdissection laser. Par conséquent, déposer les lames dans un dispositif de l’éditeur de liens d’ADN et exposer aux UV plus élevée pendant environ 10 min. Assembler la lame revêtement membrane dans un cytocentrifuge et cytospin la suspension de toute cellule à 300 x g pendant 5 min.Remarque : Lorsque vous utilisez un système en liquide, où les cellules sont cytocentrifuged sur le toboggan en solution, retirer le surnageant après cytocentrifugation et appliquer un sèche-spin à 1140 x g pendant 1 min. Passez directement à la microdissection de laser ou de laisser le cytospins sécher pendant la nuit et congeler les échantillons à-20 ° C pour le stockage à long terme. Pipeter 4,5 µL du mélange maître de cellule lysis dans le bouchon d’un tube PCR de 0,2 mL et récolter les cellules individuelles par le biais de microdissection laser. Extraire le tube PCR du microscope microdissection laser et fermer le tube. Recueillir tout le liquide au fond du tube par court-spin et placez l’échantillon sur la glace. Poursuivez le WGA monocellulaires ou stocker les échantillons isolés à-80 ° C pendant environ 1 mois avant traitement ultérieur. 6. adaptateur-linker basé du génome entier amplification 18,19 Remarque : Assurez-vous que tous les mélanges maîtres nécessaires (composants du kit WGA, Table des matières et réactifs) sont préparés et stockés sur glace prête à l’emploi. Mélanges maîtres comprennent le mélange de digestion de l’ADN 1 pour micromanipulés (voir 5.1) échantillons (contenant 2,0 µL de tampon de réaction, 2,0 µL de Msej’ai enzymes de restriction et de 16,0 µL d’eau exempte de RNase/DNase) ou digestion de l’ADN mélanger 2 pour microdissection laser (voir 5.2.) échantillons (contenant 2,5 µL de Msej’enzymes de restriction et 2,5 µL d’eau exempte de RNase/DNase), recuit pré mélange principal (contenant 5,0 µL de tampon de réaction, 5,0 µL de chacune des cartes preannealing PCR et 15,0 µL d’eau exempte de RNase/DNase), ligature mélange principal (contenant 30,0 µL de recuit des adaptateurs PCR, 10,0 µL de solution de triphosphate d’adénosine et 10,0 µL de solution de ligase T4) et primaire PCR master mix (contenant 30,0 µL d’un tampon PCR, 20,0 µL de solution de mélange désoxyribonucléosides 10 mM, 10,0 µL d’une polymérase mixage et 340,0 µL d’eau exempte de RNase/DNase). Tous les volumes sont donnés pour la préparation de 10 échantillons. Ajuster en conséquence le nombre d’échantillons. Pour la lyse cellulaire, placer les échantillons de microdissection laser/micromanipulés dans un thermocycleur et exécuter la lyse de la cellule unique en incubant les cellules à 42 ° C pendant 45 min, 65 ° C pendant 30 min et 80 ° C pendant 10 min.Remarque : Utiliser un thermocycleur avec un couvercle chauffé. La lyse cellulaire est possible O/N pendant 10 à 15 h. Dans ce cas, omettez l’étape d’incubation à 65 ° C. Courir avant recuit des adaptateurs PCR. Par conséquent, incuber le mélange maître avant recuit dans un thermocycleur à 65 ° C pendant 1 min, suivie par plus de 49 cycles, 1 min chacun, à diminuer progressivement la température de 1 ° C/cycle. Après 50 cycles (à 15 ° C), incuber master mix à 15 ° C jusqu’à l’utilisation ultérieure.Remarque : Cette étape est nécessaire pour générer asymétriques adaptateurs appropriés pour la ligature (Voir l’étape 6,6) avec l’ADN de la cellule unique soumis à Mseje Sommaire de restriction. Après la lyse cellulaire, tournez en bas les échantillons lysés à 2000 g pendant 3 s pour recueillir tout le liquide au fond et placez-le sur la glace. Pour le fragment d’ADN, ajouter 2 µL du mélange digestion ADN 1 à chaque échantillon micromanipulés lysés ou 0,5 µL de la digestion de l’ADN mélanger 2 à l’échantillon de microdissection laser et exécution sommaire de restriction. Utiliser un thermocycleur avec un couvercle chauffé à 37 ° C pendant 5 min, suivie d’une étape de l’inactivation des enzymes de restriction à 65 ° C pendant 5 min.Remarque : La Digestion à 37 ° C peut être étendue à 3h. Il s’agit de la seule étape de protocole diffère entre les échantillons obtenus à partir de micromanipulation et obtenu de microdissection laser. Tournez en bas les échantillons pour recueillir tout le liquide au fond et placez-le sur la glace. Pour ligaturer DNA restriction digérée et adaptateurs préalablement recuites, ajouter 5,0 µL du maître ligature mélanger à chaque échantillon d’ADN digéré et ligaturer il dans un thermocycleur à 15 ° C pendant 1 h.Remarque : Cette étape peut être étendue à 12 h ou effectué O/N. Tournez en bas les échantillons pour recueillir tout le liquide au fond et placez-le sur la glace. Pour WGA ajouter 40,0 µL du mélange maître primaire de PCR pour chacun des produits la ligature et exécuter WGA dans un thermocycleur avec un couvercle chauffant comme suit : d’abord, incuber les échantillons à 68 ° C pendant 3 min. Deuxièmement, cycle pour 15 fois à 94 ° C pendant 40 s, 57 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 1 min 30 s + 1 s/cycle. Puis ajoutez 9 cycles à 94 ° C pendant 40 s, 57 ° C ± 1 ° C/cycle pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min 45 s + 1 s/cycle. Par la suite, cycle pour 23 fois à 94 ° C pendant 40 s, 65 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min 53 s + 1 s/cycle. Enfin, effectuer une extension finale à 68 ° C pendant 3 min 40 s et refroidir les échantillons à 4 ° C. Tournez en bas les échantillons de recueillir tout le liquide au fond et de vérifier la qualité de l’ADN ou de stocker les échantillons à-20 ° C ou à-80 ° C pour le stockage à long terme. 7. contrôle de la qualité des produits WGA Remarque : Vérifier la qualité des produits WGA basés sur la gamme de l’ADN de Papanicolaou et le nombre de produits d’amplification après avoir exécuté un 4plex QC-PCR 5. Exécuter les aliquotes WGA et des échantillons respectifs de QC-PCR sur un gel d’agarose de 1,0 % pour l’évaluation. Préparer les solutions µM 100 de toutes les amorces utilisées pour le contrôle de la qualité 4plex PCR (tableau 1). Ajouter 8 µL de chaque amorce à 136,0 µL d’eau PCR-grade pour générer 200 µL de la piscine de l’apprêt. Vortex la solution pendant 3 s, le tourner vers le bas à 2000 x g pendant 3 s et l’aliquote de 20 µL de conservation à-20 ° C. Utilisation des kits PCR standard pour préparer un master de PCR multiplex mélangent contenant 6,0 µL de 2 composants de x PCR (à l’exception des amorces), 4,5 µL d’eau PCR-grade et 0,5 µL de la piscine de l’apprêt. Ajouter 1,0 µL des produits WGA, pivoter vers le bas et exécution PCR à 94 ° C pendant 2 min suivi par 35 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 1 min, apprêt recuit à 56 ° C pendant 1 min et extension d’amorce à 72 ° C pendant 1 min 30 s et une étape finale extension à 72 ° C pendant 7 min. refroidir à 4 ° C, pivoter vers le bas et placer les échantillons sur la glace pour gel analyse le même jour ou à-20 ° C pour une analyse ultérieure.NOTE : Dans le thermocycleur de refroidissement peut être effectuée à 12 ° C, pour augmenter la longévité des éléments Peltier. Analyser les produits WGA (obtenues par 6.8.) et 4plex respectifs QC-PCR sur un gel d’agarose5.