Реальном времени дрожат индуцированной Assay преобразования для обнаружения CWD прионов в фекалии

Прионы заболеваний или трансмиссивные формы губкообразной энцефалопатии (TSE) являются нейродегенеративных расстройств, включая болезни Крейтцфельда – Якоба (CJD) в организме человека, губчатой энцефалопатией (BSE) крупного рогатого скота, почесуха овец и коз и хронической тратить болезнь (CWD) в оленей ^1,2. ТГЭ характеризуются отличительной губкообразная внешний вид и потери нейронов в головном мозге. Согласно гипотезе «только белок» прионы главным образом состоят из ОТР^Sc («Sc» для почесуха) ³, смятых изоформы хост кодировке сотовой прионных белков, ОТР^C. PrP^Sc является результатом преобразования ОТР^C в конформации, обогащенный ᵦ-листы ^4,5,6 , который может выступать в качестве семян для привязки и преобразования других молекул PrP^C . Созданное молекулы PrP^Sc включены в растущей ^7,полимерных⁸ который разбивается на небольшие олигомеров, что приводит к росту числа инфекционных ядер. PrP^Sc склонной к агрегации и частично устойчив к протеаз ^9,10.

CWD влияет на диких и выращиваемых лося (Cervus canadensis), mule олени (рода hemionus), белохвостый олень (WTD; Виргинский рода), лося (Alces alces) и олень (Rangifer tarandus tarandus) ^11,12,13. Он считается наиболее заразных болезней китовая птичка с горизонтальной передачи cervid взаимодействия и экологической устойчивости инфективности ^14,15. В отличие от других прионных заболеваний, где PrP^Sc накопления и инфективности приурочены к мозгу в ухо они также находятся в периферических тканях и жидкостях организма например слюна, моча и фекалии ^{16,17, 18}.

Иммуногистохимия считается золотым стандартом для CWD диагностики для обнаружения PrP^Sc распределения и губчатые поражения ^19,20. ELISA и в более редких случаях, Западная помарка также используются для диагностики CWD. Таким образом текущие диагноз болезни прионных главным образом основывается на выявлении прионов в тканях трупа. Ante-mortem диагноз для CWD доступен, принимая миндалин или биопсии ректо анальный слизистой оболочки связанных лимфоидной ткани (RAMALT); Однако эта процедура является инвазивным и требует захвата животных. Таким образом легко доступных образцов, таких как моча и фекалии, будет использоваться практический способ обнаружения CWD китовая птичка. Однако эти экскременты гавань относительно низкие концентрации прионов ниже предела обнаружения текущих методов диагностики. Следовательно необходима более чувствительной и высокой пропускной способности диагностический инструмент. В vitro преобразования систем, таких как белок, сворачиванию циклических усиления анализа (PMCA) ²¹, амилоид посева пробирного и реальном времени дрожат индуцированной преобразования (RT-QuIC) пробирного ^{22,23, 24} являются очень мощными инструментами для использования самостоятельного размножения ОТР^Sc способность имитировать в vitro процесс преобразования китовая птичка и тем самым усилить присутствие мизерных количествах^Sc PrP к обнаружению уровней ^{25 ,26}. RT-QuIC метод, однако, использует тот факт, что преобразование продукт, обогащенный в вторичной структуре β-лист конкретно можно привязать Тиофлавин Т (Th-T). Таким образом рекомбинантных ОТР (rPrP) после преобразования в сеяный перерастает в амилоидных фибрилл, которые связывают Th-T и таким образом могут быть обнаружены в реальном времени путем измерения флуоресценции Th-T выражается относительной флуоресценции единиц (РФС) со временем. После того, как мониторинг, РФС может использоваться для оценки относительной посева мероприятия и количественные параметры, такие как лаг-фазы. Лаг-фаза представляет собой время (h) требуется достичь порога, во время которого rPrP преобразования на ранней стадии реакции находится ниже предела обнаружения Th-T флуоресценции. Конец этапа явное отставание, сопутствующие формирования достаточного амилоида ядра (нуклеации/удлинение), происходит, когда Th-T флуоресценции превышает пороговый уровень и становится положительным. Рост амилоида, которую фибриллами могут быть обнаружены в реальном времени и первоначальный PrP^Sc или заполнения деятельности, содержащихся в образце усиливается сегментации, которая генерирует больше семян. Эти семена в свою очередь вызывают быстрое экспоненциальной фазе роста амилоида волокна.

Потому что этот assay может обнаружить как низко как 1 fg ОТР^{Sc 24}, высокая чувствительность квалифицирует эту технику для достижения ante mortem или неинвазивной диагностики путем обнаружения PrP^Sc в различных периферийных тканей, экскременты или других виды образцов, укрывательство низкий уровень инфекционности. RT-QuIC определенно имеет преимущества перед другими анализов его воспроизводимости, практичности, быстрота (менее 50 h) и низкие расходы по сравнению с bioassays. Это позволяет избежать технические сложности, такие как sonication, используемые в PMCA; Кроме того она выполняется в запечатанные лентой микроплиты, которая минимизирует риск загрязнения аэрозоля каждой скважины. Несколько хорошо формат позволяет анализ образцов до 96 в том же эксперименте. Для противодействия периодические проблемы ложных срабатываний и спонтанное преобразования rPrP в конверсии в vitro анализов осуществление порог (отсечения) в RT-QuIC является очень полезным. Действительно основываясь на результатах отрицательного контроля (средняя РФС негативные примеры + 5 SD ²⁷), базовый создан из которого может осуществляться дискриминация между положительным и отрицательным образцы. Использование четырех репликация для каждого образца таким образом может помочь определить образец как позитивные, когда по меньшей мере 50% реплицирует показывают позитивный сигнал, т.е. крест отсечения ²⁸. Гомологии между семенем и субстрат не требуется в RT-QuIC, как например в предыдущем исследовании, хомячок rPrP был найден, чтобы быть более чувствительным субстрата, по сравнению с гомологичных субстрата в человека PrP^вБКЯ семенами и скрепи овец посеян реакции ²⁹. Хомяк овец химерных rPrP было также предложено быть подложке более подходящим чем человека rPrP обнаружить человека вариант CJD прионов ³⁰. Таким образом использование rPrP субстратов из различных видов является очень распространены в этот assay. Этот assay был успешно применен к несколько прионных заболеваний, таких как спорадические CJD ^31,,3233, генэтический прионных заболевания ³⁴, BSE ^35,,3637, почесуха ^23,36и CWD ^{38,,3940,41, 42}. Исследования с использованием обработанных спинномозговой жидкости, цельной крови, слюны и мочи, как семена в RT-QuIC все удалось обнаружить PrP^{Sc 38,,3940,41, 42}. для укрепления способности обнаружения в пробах как плазмы крови, которая может содержать ингибиторы амилоида формирования, Orrú и др. (2011) разработала стратегию для удаления потенциальных ингибиторов амилоида формирования расчесывать PrP^Sc иммунопреципитации (IP) шаг и RT-QuIC, под названием «расширение QuIC» проба (eQuIC). Кроме того замена шаг субстрата работал после ~ 24 h время реакции для того, чтобы улучшить чувствительность. В конечном итоге, как низко как 1 ag ОТР^СК было обнаруживаемых eQuIC ³⁰.

Чтобы очистить фекалии экстрактов и удалить возможные пробирного ингибиторы в фекалиях, фекальных пробах на доклинических и клинических стадиях лося на экспериментальной устные инфекции были гомогенизированные в буфер, содержащий моющих средств и ингибиторов протеазы. Фекалии экстракты далее были представлены различные методологии сконцентрировать PrP^Sc в образцах используя осадков белок через натрия фосфорвольфрамовой кислоты (NaPTA) осадков. Метод NaPTA осадков, впервые описан Сафар- et al. ⁴³, используется сконцентрировать PrP^Sc в испытательных образцов. Инкубационный NaPTA с результатами выборки преференциальных осадков ОТР^Sc , вместо того, чтобы ОТР^C. Однако молекулярный механизм до сих пор неясно. Этот шаг также помог сдерживания и предотвращения спонтанного преобразования rPrP, который наблюдается в некоторых случаях. Наконец экстракты фекалии были протестированы оптимизированный RT-QuIC с помощью rPrP (aa 23-231) мыши как субстрат и включая замену субстрата в протоколе улучшить чувствительность обнаружения.

Результаты здесь продемонстрировать, что этот усовершенствованный метод может обнаружить очень низких концентрациях CWD прионов и увеличивает чувствительность обнаружения и специфичность в фекальных пробах, по сравнению с протокол без осадков и субстрата замены NaPTA. Этот метод потенциально могут быть применены в других тканях и жидкостях организма и может быть полезным для CWD наблюдения в диких и плен оленей.