JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/56373
, , , , ,
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine,University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology,University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency,Lethbridge Laboratories

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור טכניקה פשוטה, מהירה ויעילה פריון הגברה, השיטה בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר).

Abstract

טכניקת RT-מהר היא רגיש במבחנה פריון תא ללא הגברה assay בהתבסס בעיקר על הזריעה misfolding צבירה של פריון רקומביננטי לסובסטרט חלבון (PrP) באמצעות זרעים פריון כתבנית עבור ההמרה. RT-מהר היא טכניקה תפוקה גבוהה חדשניים אשר הוא אנלוגי לאופרטור תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (PCR). זיהוי של צמיחה עמילואיד fibril מבוסס על לצבוע Thioflavin T, אשר שזוהר על אינטראקציה מסוימת עם חלבונים עשיר ᵦ-גיליונות. לפיכך, היווצרות עמילואיד יכול להתגלות בזמן אמת. אנחנו ניסה לפתח אמין לא פולשנית לעבור בדיקה לגילוי כרונית prions המחלה (CWD) מבזבז את תמצית צואה. כאן, אנחנו במפורש הסתגלו הטכניקה RT-מהר כדי לחשוף PrPSc זריעה פעילות צואה של CWD נגוע cervids. בתחילה, הפעילות זריעה של תמציות צואה הכנו היה נמוך יחסית ב- RT-מהר, כנראה עקב פוטנציאליים מעכבי assay בחומר צואה. כדי לשפר את פעילות זריעה של צואה תמציות ולהסיר מעכבי assay פוטנציאליים, אנחנו הומוגני דגימות צואה במאגר המכיל חומרי ניקוי, מעכבי פרוטאז. הגשנו גם את הדוגמאות כדי מתודולוגיות שונות להתרכז PrPSc על בסיס חלבון משקעים באמצעות חומצה phosphotungstic נתרן, ואת כוח צנטריפוגלי. לבסוף, תמציות צואה נבדקו על ידי אופטימיזציה RT-מהר שכלל החלפת המצע בפרוטוקול כדי לשפר את רמת הרגישות של זיהוי. לכן, הקמנו פרוטוקול גילוי רגיש של פריון CWD זריעה פעילות צואה של ניסויים פרה-קליניים ומחקרים קליניים cervids מאת RT-מהר, אשר יכול להיות כלי שימושי לאבחון CWD לא פולשנית.

Introduction

פריון מחלות או מדבקות spongiform encephalopathies (TSE) הן הפרעות ניווניות כולל מחלת קרויצפלד – יעקב (מחלת קרויצפלד-. יעקב) בבני אדם, ספגת המוח (BSE), בקר, scrapie כבשים, עיזים, ואת מבזבז כרונית המחלה (CWD) cervids 1,2. TSEs מאופיינים במראה ייחודי spongiform ואובדן של נוירונים במוח. על-פי ההנחה “חלבון בלבד”, prions מורכבים בעיקר PrPSc (‘Sc’ עבור scrapie) 3, isoform misfolded החלבון מקודד מארח את הסלולר פריון, PrPC. PrPSc נובעת ההמרה של PrPC לתוך קונפורמציה מועשר בגליונות ᵦ 4,5,6 אשר יכול לשמש זרע לאגד, להמיר מולקולות אחרות PrPC . מולקולות PrPSc החדש שנוצר משולבים גדל פולימר 7,8 אשר פורץ oligomers קטנים יותר, וכתוצאה מכך מספר גבוה יותר של גרעינים זיהומיות. PrPSc נוטה צבירת והיא עמידה חלקית פרוטאזות 9,10.

CWD משפיע על אייל מעובדים הפראית (Cervus קנדית), אייל פרדי שחור זנב (האייל hemionus), אייל פרדי לבן זנב (WTD; האייל virginianus), מוס (Alces alces), איילים (Rangifer tarandus ב tarandus ב) 11,12,13. היא נחשבת למחלה מדבקת ביותר פריון עם העברה אופקית המועדף על ידי אינטראקציות cervid והתמדה סביבתי של 14,infectivity15. שלא כמו מחלות אחרות פריון איפה PrPSc הצטברות ו infectivity מרותקים אל המוח, ב- CWD אלה מצויים גם רקמות היקפיים של נוזלי הגוף למשל רוק, שתן, צואה 16,17, 18.

אימונוהיסטוכימיה נחשב תקן הזהב לאבחון CWD לזהות PrPSc הפצה ו- spongiform נגעים 19,20. אליסה במקרים נדירים יותר, תספיג המשמשות גם עבור אבחון CWD. לכן, אבחון מחלת פריון הנוכחי מתבסס בעיקר על זיהוי prions ברקמות פוסט-מורטם. המוות. אבחנה CWD זמין על ידי לקיחת השקדים או ביופסיות recto-אנאלי רירית הקשורים רקמת הלימפה (RAMALT); עם זאת, הליך זה הוא פולשני ודורש לכידתו של בעלי החיים. לפיכך, השימוש של דגימות נגיש בקלות, כגון שתן וצואה, תהיה דרך מעשית לזיהוי פריון CWD. עם זאת, הנמל הפרשות האלה נמוך יחסית ריכוזי prions מתחת לגבול זיהוי של שיטות אבחון הנוכחי. כתוצאה מכך, נדרש יותר רגיש וגבוה תפוקה של כלי אבחון. במבחנה המרת מערכות, כגון חלבון misfolding הגברה מחזורית assay (PMCA) 21, עמילואיד זריעה assay, בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר) assay 22,23, 24 הם כלי רב עוצמה כדי לנצל היכולת שמתרבה של PrPSc לחקות במבחנה את תהליך ההמרה של פריון, ובכך להגביר את הנוכחות של כמויות זעירות של PrPSc לרמות לזיהוי 25 ,26. שיטת RT-מהר, עם זאת, מנצל העובדה כי המוצר ההמרה מועשר בβ-גיליון מבנה שניוני באפשרותך לאגוד במיוחד thioflavin T (ה-T). לכן, PrP רקומביננטי (rPrP) בעת הזריעה ההמרה גדל לתוך הסיבים עמילואיד אשר לאגד את ה-T, לכן ניתן להבחין בזמן אמת באמצעות מדידה של זריחה של ה-T לבטא יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (RFU) לאורך זמן. ברגע תחת פיקוח, RFU יכול לשמש כדי להעריך היחסי זריעה, ופעילויות פרמטרים כמותיים כגון שלב ההשהיה. השלב לג מייצג את הזמן (h) הנדרש כדי להגיע לסף, במהלך rPrP אשר המרה בשלב מוקדם של התגובה הוא מתחת לגבול זיהוי של ה-T זריחה. בסוף שלב ההשהיה לכאורה, והמצוות להיווצרות של גרעין עמילואיד מספיקות (התגרענות/התארכות), מתרחש כאשר קרינה פלואורסצנטית ה-T חורג רמת הסף הופך להיות חיובי. הצמיחה של עמילואיד הסיבים יכול להתגלות בזמן אמת, PrP הראשוניתSc או זריעה פעילות הכלולים במדגם מוגבר על ידי פילוח אשר מפיק יותר זרעים. זרעים אלה לגרום בתורו שלב מעריכי מהירה של סיבי עמילואיד צמיחה.

כי זה וזמינותו הוא מסוגל לזהות המתחילים 1 fg PrPSc 24, רגישות גבוהה מסמיך בטכניקה זו כדי להשיג את ההימור המוות או אבחון פולשני על ידי גילוי PrPSc שונים רקמות היקפיים, הפרשות או השני סוגים של הדגימה מחסה רמות נמוכות של infectivity. RT-מהר בהחלט מספק יתרונות אחרים מבחני שלו הפארמצבטית, פרקטיות, במהירות (פחות מ- 50 h), עלויות נמוכות בהשוואה bioassays. זה מונע את המורכבות הטכנית כגון sonication בשימוש PMCA; בנוסף, זה מתבצע ב- microplate הקלטת אטום אשר ממזער את הסיכון של זיהום תרסיס של כל טוב. התבנית מרובת טוב המאפשרת הניתוח של דוגמאות עד 96 אותו ניסוי. כדי לסתור את הבעיה חוזרים ונשנים של תוצאות חיוביות שגויות והמרה ספונטנית של rPrP ב מבחני הגיור במבחנה המימוש של סף (ניתוק) ב- RT-מהר הוא מאוד שימושי. אכן, על סמך התוצאות של הפקד שלילי (ממוצע RFU של דגימות שליליות +5 SD 27), תוכנית בסיסית מוגדר שממנו ניתן לעשות אפליה בין דוגמאות חיוביות ושליליות. השימוש של משכפל 4 עבור כל דגימה כך יכול לסייע להגדרת מדגם חיוביים כאשר לפחות 50% של משכפל הצג סימן חיובי, כלומר לחצות את ניתוק 28. הומולוגיה בין הזרע לבין המצע לא נדרש ב- RT-מהר, כמו למשל במחקר הקודם, אוגר rPrP נמצאה להיות מצע רגיש יותר בהשוואה המצע הומולוגי ב PrP האנושיvCJD נזרע הצאן scrapie נזרע תגובות 29. rPrP chimeric אוגר-כבשים הוצעה גם להיות מצע מתאים היטב יותר מאשר rPrP האנושית לזהות האנושית variant מחלת קרויצפלד-יעקב prions 30. לפיכך, השימוש rPrP סובסטרטים של מינים שונים נפוץ מאוד בזה וזמינותו. Assay זו הוחלה בהצלחה מספר מחלות פריון, כמו “טפטוף” מחלת קרויצפלד-יעקב 31,32,33, מהדור השניפריון etic מחלות 34, BSE 35,36,37, scrapie 23,36, CWD 38,39,40,41, 42. מחקרים באמצעות עיבוד נוזל מוחי שדרתי, דם, רוק, שתן כמו זרעים ב RT-מהר היו כולן מוצלחות כדי לזהות PrPSc 38,39,40,41, 42. לטפח את יכולת זיהוי בדגימות כמו פלזמה שעשויים להכיל מעכבי היווצרות עמילואיד, Orrú et al. (2011) פיתחה אסטרטגיה כדי להסיר מעכבי פוטנציאל היווצרות עמילואיד בסירוק שלב immunoprecipitation (IP) PrPSc ו- RT-QuIC, בשם assay “משופרת QuIC” (eQuIC). בנוסף, צעד החלפת המצע הועסק לאחר ~ 24 שעות של זמן התגובה על מנת לשפר את הרגישות. בסופו של דבר, כמו נמוך כמו 1 ag של PrPSc היה ניתן לגילוי על ידי eQuIC, 30.

על מנת לטהר צואה תמציות ולהסיר assay אפשרי מעכבי בצואה, דגימות צואה שנאסף בשלבים קליניות אייל על זיהום אוראלי ניסיוני היו הומוגני במאגר המכיל חומרי ניקוי, מעכבי פרוטאז. צואה תמציות נוספות הוגשו מתודולוגיות שונות להתרכז PrPSc הדגימות ניצול החלבון משקעים באמצעות סודיום phosphotungstic חומצה (NaPTA) משקעים. שיטת משקעים NaPTA, תיאר לראשונה על ידי צפר. et al. 43, משמש להיכנס למצב של ריכוז PrPSc הבדיקה דוגמאות. הדגירה של NaPTA עם תוצאות המדגם בכמות המשקעים מועדף PrPSc ולא PrPC. עם זאת, מנגנון מולקולרי הוא עדיין לא ברור. שלב זה סייע המכיל ומונעים את ההמרה ספונטנית של rPrP, אשר נצפית במקרים מסוימים. לבסוף, תמציות צואה נבדקו על ידי אופטימיזציה RT-מהר באמצעות העכבר rPrP (aa 23-231) כמו מצע, כולל החלפת המצע בפרוטוקול כדי לשפר את רמת הרגישות של זיהוי.

התוצאות כאן מדגימים כי שיטה משופרת זו ניתן לזהות ריכוזים נמוכים מאוד של CWD prions ומגביר את הרגישות של זיהוי וספציפיות דגימות צואה בהשוואה פרוטוקול ללא החלפה משקעים, המצע NaPTA. שיטה זו פוטנציאל שניתן להחיל על רקמות ו נוזלי גוף אחרים, יכול להיות תועלת רבה למעקב CWD ב cervids בשבי הפראית.

Protocol

1. החומר הצואתי באמצעות RT-מהר homogenate הכנת cervid צואה תמציות לעשות צואה על-ידי הוספת 1 g של החומר הצואתי 10 מ”ל של צואה לחלץ מאגר (20 מ מ סודיום פוספט, pH 7.1, 130 מ מ NaCl. 0.05% Tween 20, 1 מ PMSF ו- 1 x להשלים מעכבי פרוטאז, נטולת EDTA) לתת ריכוז סופי של 10% (w/v). המאגר המגון יכול להיות מוכן לפני הניצול ומאו…

Representative Results

תמציות צואה CWD מוכן ב-10% (w/v) הצליחו זרע התגובה RT-מהר, אך הרגישות של זיהוי היה נמוך 27. באמצעות מאגר ספציפי עבור המגון צואה היה צעד קריטי כדי להימנע רקע זריחה ב- RT-מהר תגובות והמצוות לשימוש בעכבר rPrP המצע במקום rPrP הצבאים אשר אפשרה להגיע ספציפי יותר תוצאות 2…

Discussion

RT-מהר קודם לכן הועסק לזהות CWD prions שתן ותמציות צואה של אייל פרדי לבן זנב, אייל פרדי שחור זנב דרך הפה הנגוע 38. מערכת שמוצג בכתב היד היא שיטה מותאם וזמינותו RT-מהר. צעדים נוספים אוחדו וזמינותו RT-מהר “הקלאסי” כדי לשפר את זיהוי ואת הרגישות של וזמינותו עבור CWD prions בחומר צואה של חיות נגועו?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו אסירי תודה ד ר ביירון Caughey (NIH מעבדות הר סלעי) עבור מספקים את פלסמיד חיידקי הביטוי PrP cervid והדרכה. SG נתמך על-ידי התוכנית קנדה מחקר הכיסא. אנו להכיר מימון למחקר זה ס ג מן הגנום קנדה, אלברטה פריון מכון מחקר, אלברטה לחקלאות ויערנות דרך הגנום אלברטה, מאוניברסיטת קלגרי לתמיכה עבודה זו. אנו להכיר במענק מחקר של הקרן גאן מרגרט לחקר בעלי חיים.

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Tags

CWD PrionsFecal MaterialReal-time Quaking-induced Conversion AssayCervidChronic Wasting DiseaseSensitive DetectionHigh ThroughputSodium Phosphotungstic Acid PrecipitationRT-QuIC AssayThioflavin T

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image