En temps réel Quaking induite par le test de Conversion pour détection de CWD Prions dans les matières fécales

Les maladies à prions ou encéphalopathies spongiformes transmissibles (est) sont des maladies neurodégénératives comme la maladie de Creutzfeldt – Jakob (SCJ) chez l’homme, encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) chez les bovins, la tremblante chez les ovins et les caprins et gaspillage chronique maladie (CWD) chez les cervidés ^1,2. Est se caractérisent par l’aspect distinctif spongiforme et la perte de neurones dans le cerveau. Selon l’hypothèse de « protéine seule », prions sont principalement composées de PrP^Sc (« Sc » pour la tremblante) ³, une isoforme forme anormale de la protéine prion cellulaire hôte codé, PrP^C. PrP^Sc résulte de la conversion de la PrP^C dans une conformation enrichie en ᵦ-feuilles ^4,5,6 , qui peut agir comme une graine de lier et de convertir les autres molécules PrP^C . Les molécules nouvellement créées de la PrP^Sc sont incorporés dans un croissant polymère ^7,8 , qui se brise en petits oligomères, résultant en plus grand nombre de noyaux infectieuses. PrP-^Sc est sujette à l’agrégation et est partiellement résistante aux protéases ^9,10.

CWD affecte sauvages et d’élevage de wapiti (Cervus canadensis), le cerf mulet (Odocoileus hemionus), le cerf de Virginie (WTD ; Odocoileus virginianus), l’orignal (Alces alces) et le renne (Rangifer tarandus tarandus) ^11,12,13. Il est considéré comme la plus contagieuse maladie à prions avec transmission horizontale, favorisée par des interactions de cervidés et de persistance dans l’environnement de l’infectivité ^14,15. Contrairement à d’autres maladies à prions, où l’accumulation de PrP^Sc et l’infectiosité sont confinés au cerveau, gros débris ligneux ceux-ci sont également présents dans les tissus périphériques et les liquides organiques par exemple salive, l’urine et fèces ^{16,17, 18}.

Immunohistochemistry est considéré comme l’étalon-or pour le diagnostic de la DLG détecter les PrP^Sc distribution et spongiforme lésions ^19,20. ELISA et dans de plus rares cas, la tache occidentale sont également utilisés pour le diagnostic de DLG. Ainsi, diagnostic des maladies à prions actuelle repose essentiellement sur la détection des prions dans les tissus post-mortem. Diagnostic ante-mortem CWD est disponible en prenant des amygdales ou des biopsies de tissu lymphoïde associé aux muqueuses recto-anal (test RAMALT) ; Toutefois, cette procédure est invasive et nécessite la capture des animaux. Ainsi, l’utilisation de spécimens facilement accessibles, tels que l’urine et les selles, serait une façon pratique pour la détection du prion CWD. Toutefois, le port de ces excréments des concentrations relativement faibles de prions inférieure au seuil de détection des méthodes actuelles de diagnostic. Par conséquent, un outil de diagnostic de débit plus sensible et plus élevée est nécessaire. In vitro le systèmes de conversion, comme la protéine misfolding cyclique amplification assay (PMCA) ²¹, amyloïde ensemencement dosage et conversion induite par le tremble en temps réel (RT-QuIC) dosage ^{22,23, 24} sont des outils très puissants pour exploiter la capacité propageant des PrP^Sc à reproduire in vitro le processus de conversion de prion et ainsi amplifier la présence de quantités infimes de PrP^Sc à des niveaux détectables ^{25 ,26}. La méthode RT-QuIC, cependant, tire parti du fait que le produit de conversion enrichi en feuillet β structure secondaire peut lier spécifiquement thioflavine T (Th-T). Par conséquent, PrP recombinante (PRPR) lors de la conversion ensemencée se développe en fibrilles amyloïdes qui se lient Th-T et peuvent ainsi être détectées en temps réel par la mesure de la fluorescence du Th-T exprimée en unités (RFU) de la fluorescence relative au fil du temps. Une fois contrôlé, la RFU peut être utilisée pour évaluer les activités d’ensemencement relatives et paramètres quantitatifs tels que la phase de latence. La phase de latence représente le temps (h) requis pour atteindre le seuil, au cours de laquelle PRPR conversion dès les premiers stades de la réaction est inférieure au seuil de détection de la fluorescence de Th-T. La fin de la phase de latence apparente, concomitante à la formation d’un noyau amyloïde suffisante (nucléation/allongement), se produit lorsque la fluorescence Th-T dépasse le niveau de seuil et devient positive. La croissance de la substance amyloïde fibrilles peuvent être détectées en temps réel et de l’initiale PrP^Sc ou semie activité contenue dans l’échantillon est amplifiée par la segmentation qui génère plus de graines. Ces graines induisent à son tour une rapide phase exponentielle de croissance de fibres amyloïdes.

Parce que ce test est capable de détecter aussi bas que 1 fg des PrP^{Sc 24}, la haute sensibilité qualifie cette technique pour atteindre ante mortem ou diagnostic non invasif en détectant les PrP^Sc dans divers tissus périphériques, excréments ou autre types de spécimens ayant de faibles niveaux d’infectiosité. RT-QuIC constitue certainement avantages par rapport aux autres épreuves pour sa reproductibilité, praticité, rapidité (moins de 50 h) et de faibles coûts par rapport aux essais biologiques. Elle évite les complexités techniques comme la sonication utilisé dans PMCA ; en outre, il est pratiqué dans une microplaque ruban étanche qui minimise le risque de contamination des aérosols de chaque puits. Le format multipuit permet l’analyse des échantillons jusqu’à 96 dans la même expérience. Pour contrer le problème récurrent de faux positifs et de la conversion spontanée du PRPR dans les essais de conversion in vitro , la mise en œuvre d’un seuil (cut-off) en RT-QuIC est très utile. En effet, selon les résultats du contrôle négatif (RFU moyenne des échantillons négatifs + 5 SD ²⁷), une ligne de base est mis en place d’où on peut faire la discrimination entre les échantillons positifs et négatifs. L’utilisation de quatre répétitions de chaque échantillon peut donc aider à définir un échantillon positif quand au moins 50 % des répliques montre un signal positif, c’est-à-dire franchir le seuil de ²⁸. L’homologie entre les graines et le substrat n’est pas nécessaire dans le RT-QuIC, comme par exemple dans une étude antérieure, hamster PRPR a trouvé un substrat plus sensible par rapport au substrat homologue en humain PrP^vMCJ épépiné et tremblante du mouton ensemencées réactions ²⁹. hamster-moutons chimérique PRPR a également été suggéré d’être un substrat plus adapté que PRPR humain pour détecter des prions de MCJ variante humaine ³⁰. Ainsi, l’utilisation de substrats PRPR provenant de différentes espèces est très fréquente dans ce test. Ce test a été appliqué avec succès à plusieurs maladies à prions, comme sporadique MCJ ^31,32,33, genles maladies de prion ETIC ³⁴, l’ESB ^35,36,37, tremblante ^23,36et CWD ^{38,39,40,41, 42}. Des études utilisant traitement liquide céphalorachidien, sang, salive et urine comme graines à RT-QuIC étaient tous réussis pour détecter les PrP^{Sc 38,39,40,41, 42}. afin de favoriser la capacité de détection dans des échantillons tels que le plasma sanguin contenant des inhibiteurs de la formation d’amyloïde, Orrú et al. (2011) a élaboré une stratégie pour éliminer les inhibiteurs potentiels de formation amyloïde par peignage PrP^Sc immunoprécipitation (IP) étape et RT-QuIC, nommé « renforcée QuIC » test (eQuIC). En outre, une étape de remplacement de substrat a été employée après ~ 24 h temps de réaction afin d’améliorer la sensibilité. En fin de compte, comme bas que 1 ag du PrP^Sc a été détecté par eQuIC, ³⁰.

Afin de purifier des extraits de matières fécales et d’éliminer les inhibiteurs de dosage possible dans les selles, les échantillons de matières fécales recueillis aux stades précliniques et cliniques de wapiti à l’infection expérimentale orale ont été homogénéisés dans un tampon contenant des détergents et des inhibiteurs de la protéase. Les extraits de matières fécales ont été davantage soumis à différentes méthodes pour concentrer les PrP^Sc dans les échantillons utilisant la précipitation de protéines par précipitation de sodium phosphotungstique acide (NaPTA). La méthode de précipitation de NaPTA, tout d’abord décrite par Safar al. ⁴³, est utilisée pour concentrer le PrP^Sc dans les échantillons de test. L’incubation de NaPTA avec les résultats de l’échantillon dans les précipitations préférentielle de PrP^Sc plutôt PrP^C. Toutefois, le mécanisme moléculaire est encore incertain. Cette étape a également aidé contenant et empêcher la conversion spontanée du PRPR, ce qui est observé dans certains cas. Enfin, les extraits de matières fécales ont été testés par optimisé RT-QuIC en utilisant la souris PRPR (aa 23-231) comme substrat et y compris le remplacement de substrat dans le protocole pour améliorer la sensibilité de détection.

Les résultats présentés ici montrent que cette méthode améliorée peut détecter des concentrations très faibles de prions CWD et augmente la sensibilité de détection et de spécificité dans les fèces par rapport à un protocole sans remplacement de précipitation et de substrat NaPTA. Potentiellement, cette méthode peut être appliquée à d’autres tissus et les fluides corporels et peut être d’une grande utilité pour la surveillance de la CWD chez les cervidés sauvages et en captivité.