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Sciences du comportement

Uma rede sem fio, Interface bidirecional para gravação na Vivo e estimulação da atividade Neural em livremente, comportando-se ratos

Published: November 07, 2017
doi:
10.3791/56299
, , , , , , , ,
1Behavioral Neuroscience, Experimental and Biological Psychology,Philipps-Universität Marburg, 2Behavioral Neurosciences Institute (INeC), 3Thomas RECORDING GmbH, 4Department of Neurophysics,Philipps-Universität Marburg

Summary

Uma rede sem fio, sistema bidirecional para multi-canal neurais gravações e estimulação em livremente se comportando ratos é introduzido. O sistema é leve e compacto, tendo assim um impacto mínimo sobre o repertório comportamental de animal´s. Além disso, este sistema bidirecional fornece uma ferramenta sofisticada para avaliar relações causais entre os padrões de ativação do cérebro e comportamento.

Abstract

Na vivo eletrofisiologia é uma técnica poderosa para investigar a relação entre a actividade cerebral e comportamento em uma escala de milissegundos e micrômetro. No entanto, métodos atuais dependem principalmente de gravações de cabo tethered ou apenas usam sistemas unidirecionais, permitindo a gravação ou a estimulação da atividade neural, mas não no mesmo tempo ou no mesmo alvo. Aqui, uma nova rede sem fio, dispositivo bidirecional para gravação multicanal simultânea e estimulação da atividade neural em livremente se comportando ratos é descrito. O sistema funciona através de um único estágio de cabeça portátil que transmite a atividade gravada e pode ser direcionado em tempo real para a estimulação do cérebro usando um software multicanal baseado em telemetria. O palco principal é equipado com um pré-amplificador e uma bateria recarregável, permitindo gravações de longo prazo estáveis ou estimulação para até 1 h. importante, o palco principal é compacto, pesa 12 g (incluindo bateria) e, portanto, tem um impacto mínimo sobre o animal´s repertório comportamental, tornando o método aplicável a um amplo conjunto de tarefas comportamentais. Além disso, o método tem a grande vantagem que o efeito da estimulação cerebral na atividade neural e comportamento pode ser medido simultaneamente, fornecendo uma ferramenta para avaliar as relações causais entre os padrões de ativação específicas do cérebro e comportamento. Esta característica torna o método particularmente valioso para o campo da estimulação profunda do cérebro, permitindo avaliação precisa, monitoramento e ajuste dos parâmetros de estimulação durante experimentos comportamentais a longo prazo. A aplicabilidade do sistema foi validada utilizando o colículo inferior como um modelo de estrutura.

Introduction

Uma questão fundamental em neurociência é atividade como elétrica em circuitos neurais definidos gera determinadas formas de comportamento. Na vivo eletrofisiologia é uma técnica poderosa para abordar esta questão, fornecendo uma ferramenta para gravar ou estimular a atividade elétrica no cérebro, enquanto os animais estão realizando determinadas tarefas comportamentais. No entanto, os sistemas atuais frequentemente dependem cabo tethered gravações1,2, provavelmente restringir a mobilidade e impedindo a plena expressão do repertório comportamental de animal´s. Além disso, na maior parte sistemas unidirecionais são usados, permitindo que qualquer gravação3,4,5 ou estimulação6,7 da atividade neural, mas não no mesmo tempo ou mesmo alvo, tornando-se difícil de desvendar as relações causais entre os padrões de ativação específicas do cérebro e comportamento. Apenas alguns sem fio, sistemas bidirecionais para preparações na vivo estão atualmente disponíveis. No entanto, eles são geralmente pesados (40-50 g) e consistem de dois portáteis unidades separadas, ou seja, um palco principal e uma mochila conectada para poder baseado em bateria alimentação8,9,10, tornando-os menos flexível e aumentando o risco de desconexão do cabo, por exemplo, durante o Self enfeitando o comportamento. Nenhum dos acima mencionados sistemas sem fio oferecer unidades de microeletrodos implantáveis para adquirir um conceito integrado completo da atividade neural durante o comportamento ethologically válido completo com alta reprodutibilidade das condições experimentais.

Aqui, uma nova rede sem fio, dispositivo bidirecional para gravações na vivo e estimulação da atividade neural em livremente se comportando ratos é introduzido. O sistema de Wireless de Thomas (TWS) opera através de um único removível cabeça estágio que pode transmitir a atividade multicanal, usando até quatro canais de gravação independente e pode ser direcionado para estimulação elétrica do cérebro em tempo real. Além disso, uma unidade de microeletrodos cronicamente implantável compatível com o TWS foi desenvolvida que permite tanto a estimulação neural e a gravação. Também é apresentada uma interface de usuário gráfica do software TWS, para gravação e estimulação. Este estudo descreve a implementação de validação e na vivo de todo o dispositivo.

Para validar o sistema TWS o colículo inferior foi escolhido como uma estrutura neural alvo porque uma resposta comportamental evidente pode ser provocada pela sua estimulação elétrica. É amplamente conhecido que a estimulação elétrica do colículo inferior provoca incondicionadas ‘medo-like’ respostas comportamentais em ratos, como precaução, posturas lateralmente, arqueando as costas, congelamento e comportamento de fuga (fuga). Esse padrão de resposta imita reações a temer evocado por desafios ambientais, tais como um acontecimento nocivo percebido, ataque ou ameaça à sobrevivência11,12,13. Supunha-se que sendo capaz de provocar um comportamento tão claro e inequívoco proporciona um verdadeiro desafio para os TWS.

Protocol

todos os protocolos e experimentos estavam em conformidade com as actuais directrizes europeias (2010/63/UE) e aprovado pelas autoridades regionais (Regierungspräsidium Gießen, senhor 20/35 Nr.25/2015). 1. animais adultos ratos Wistar machos (200-250 g) em grupos de 3-4 em condições padrão de laboratório pelo menos uma semana antes da cirurgia para permitir que a aclimatação da casa. Dois dias após a cirurgia, ratos de casa em pares. Cobrir gaiolas simples com tampas de acrílico altas. Evitar tampas convencionais feitas de grelha metálica, desde que os implantes podem ficar presos, aumentando o risco de que eles se tornam danificado e/ou instável ao longo do tempo. 2. Cirurgia estereotáxica antes de iniciar a cirurgia, organizar e preparar o equipamento e os materiais a seguir: obter equipamento cirúrgico estéril, consistindo de tesoura estéril, sem corte-extremidade pinças, espátulas, cirúrgicas cortador, broca dental e brotos de algodão. obter drogas e produtos químicos, incluindo o isoflurano, xilocaína, cloridrato de tramadol, pomada do olho de dexpantenol, 3% de peróxido de hidrogênio, povidona iodo e 70% de etanol. Obter o material de fixação, incluindo parafusos de aço inoxidável, resina acrílica, colagem ultravioleta e protetor de cap. Obter uma unidade de microeletrodos, (i) consiste em um eletrodo de gravação única (vidro de quartzo isolado microeletrodos de platina de tungstênio, com forma de ponta cônica, diâmetro exterior: 80 µm, ponta cónica, impedância de 1 kHz: 500 kOhm) ou um tetrode (vidro de quartzo isolados de microeletrodos de platina/tungstênio 4 núcleos, diâmetro exterior: 100 µm, ponta cónica, impedância de 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) um eletrodo de estimulação (fio de platina/irídio (90% de platina, 10% de irídio), núcleo de diâmetro 125 µm, diâmetro externo de 150 µm, impedância < 10 kOhm) conectado a uma placa de contato e (iii) um eléctrodo de referência de fio de platina (diâmetro do eixo, 100 µm; figura 1A). Obter eléctrodo colado com cola solúvel em água para a unidade de microeletrodos e testados para funcionalidade pelo menos 2h de antecedência ( figura 1B). Obter um sistema convencional amarrado, consistindo de um pré-amplificador diferencial, um amplificador principal e uma bandpass filtro amplificador para gravações. Obter material adicional, tais como luvas, soro fisiológico, seringas e almofada de aquecimento. Obter em casa gaiolas (L x W x h: 42 cm x 26 cm x 38 cm). Procedimento Nota: implantação do eletrodo é executada durante uma cirurgia estereotáxica convencional sob anestesia de isoflurano. Certifique-se de que o experimentador está usando luvas, máscara cirúrgica e jaleco. Iniciar colocando o animal em uma câmara de indução de anestesia (isoflurano 4-5%, o fluxo de oxigênio 1 L/min, duração ~ 5 min). Teste para perda de reflexos (reflexos de cauda e dedo do pé) com fórceps para confirmar a anestesia profunda. Coloque a cabeça do animal em uma máscara de anestesia fixada em torno da barra de incisivo superior da armação estereotáxica e ajustar a anestesia (2-3% de isoflurano, fluxo de oxigênio 0,7-0,8 L/min). Corrigir e alinhar horizontalmente o animal ' cabeça de s no aparato estereotáxica usando barras de orelha e incisivo superior bar Raspar o campo cirúrgico usando tesouras cirúrgicas ou uma tesoura e esterilizar com iodopovidona. Colocar o animal em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia e tratar os olhos com bálsamo de olho dexpantenol para impedi-los de secagem. Injetar xylocaine (0,3 a 0,4 mL, por via subcutânea, s.c.) no centro do campo cirúrgico. Teste para perda de reflexos novamente. Fazer uma pequena incisão (1,5 cm) com um bisturi no meio do campo cirúrgico para expor o crânio. Separar a pele suavemente e remover o tecido residual usando a pinça, tesoura e espátula. Limpe cuidadosamente o crânio usando peróxido de hidrogênio-revestido cotonetes. Furos 4-5 pequenas (4,7 mm) no crânio para fixação de parafusos de aço inoxidável. Conectar o microeléctrodo unidade/eléctrodo ao pré-amplificador e anexar para o micromanipulador estereotáxica ( figura 1B e 1C). Um buraco (aproximadamente 7 mm) no crânio acima da área de destino usando as coordenadas de um atlas do cérebro de acordo com o animal utilizado. No presente estudo, posicione as pontas de eletrodo vistas o colículo inferior, utilizando as seguintes coordenadas, com o bregma, servindo como referência: anterior/posterior, − 8.8 mm; medial/lateral, 1,5 mm; e dorsal/ventral, 3,5 mm 14. Absorver qualquer sangue com cotonetes. Introduzir verticalmente a unidade de microeletrodos até as pontas de eletrodo atingem o alvo. Posicione o cabo de terra ao longo dos parafusos de aço inoxidável e sob a pele. Monitor spike atividade e cuidadosamente ajustar a posição do eletrodo com micromanipulador até atingir uma zona de neurônios ativos na estrutura alvo e detectar atividade neural com uma relação sinal-ruído adequada para spike classificação. Fixar a unidade de microeletrodos no crânio com colagem ultravioleta e cobrir o contato de placa e parafusos com resina acrílica. Injetar soro fisiológico (1 mL i.p.) e tramadol (25 mg/kg, s.c.) para prevenir a desidratação e assegurar analgesia pós-operatória, respectivamente. Desconectar a unidade de microeletrodos do porta-eletrodo usando um pincel embebida em água. Paragem de anestesia, remova cuidadosamente o rato da armação estereotáxica. Desconecte o pré-amplificador o microeléctrodo unidade Conectar-se a proteção de cap na unidade de microeletrodos implantada e desconectá-lo somente durante os procedimentos experimentais. Manter os animais em pares na casa-gaiola a partir do segundo dia após a cirurgia. Animais de monitor diariamente para possível ferida infecção, peso corporal, condição de saúde e comportamento geral por um período de 7 dias após a cirurgia. Após este período de recuperação, realizar na vivo eletrofisiologia e experimentos comportamentais. Nota: O procedimento cirúrgico dura entre 60-90 min. Durante a cirurgia, cauda filme reflexos devem ser continuamente monitorizados e ajustado de anestesia, se necessário. 3. Na Vivo Eletrofisiologia equipamento e procedimento Nota: gravações eletrofisiológicas e estimulação são executadas usando o TWS. Obter uma fase de cabeça com um pré-amplificador integrado e bateria ligada (gravação de quatro canais; analógica, gravação de intervalo de entrada: 0-12 mV pk-pk; saída de estimulação: ±625 µA; L x W x h: 24 milímetros x 22 x 12 mm; peso: 6 g sem bateria, 12 g com bateria; bateria tempo até 1 h). Nesta fase a cabeça é apropriada ser conectado diretamente à unidade de microeletrodos implantados através de um conector multipolar em miniatura ( Figura 2). Obter uma bateria (acumulador de iões de lítio, 3.7-4.2 V DC, 230 mAh, 27 x 20 mm x 6 mm, tempo de operação de 1 h) montado em cima do palco principal ( Figura 2). Se for necessário usar a substituição da bateria recarregável com capacidade de 450 mA para aproximadamente tempo de operação de 2,5 h. Certifique-se que uma luz verde acende-se na fase de cabeça enquanto a bateria está conectada ao proprietário. Obter um transceptor (transmissor-receptor) conectado a um computador pessoal via porta USB padrão e permite uma operação sem fio para até 5 m ( Figura 2E). Obter um computador pessoal com software TWS para estimulação elétrica e gravação da atividade neural ( Figura 3 e Figura 4 ). Obter um pré-amplificador amarrado e um sistema de aquisição de dados utilizado durante a cirurgia (ver item 2.1.5) para gravações e um gerador de estímulo para a estimulação, a fim de comparar a eficácia do TWS em acordado ratos uma semana após a cirurgia. Nota: A estimulação elétrica é fornecida e atividade extracelular dos neurônios único é gravada a partir da mesma unidade de microeletrodos implantados usando ambos os sistemas. Os parâmetros de estimulação (intensidade de corrente, pulso e frequência) devem ser ajustados para cada animal de acordo com a região do cérebro como alvejada. No presente estudo, um 150-250 µA, 2500 Hz corrente foi usada para estimular o colículo inferior. Comportamental ensaios Nota: uma vez que nenhuma barreira de metal é introduzida entre o transceptor e o estágio de cabeça animal, a TWS é aplicável a um amplo conjunto de tarefas comportamentais. Como testes de comportamentais exemplares, foi usado em campo aberto para medição de atividade comportamental geral e da elevada além de labirinto, um teste padrão para avaliar o comportamento de ansiedade em roedores 15. Uma câmera de vídeo foi colocada centralmente acima campo aberto e elevada mais labirinto para gravações comportamentais. Antes do teste comportamental, lidar com cada animal em três dias consecutivos (5 min a cada dia). Antes de cada período de tratamento de conectar o palco principal com bateria para a unidade de microeletrodos implantada anteriormente. Não faça qualquer gravação ou estimulação durante o manuseio. Campo aberto Coloque o rato no centro do campo aberto (40 x 40 cm x 40 cm; vermelho ~ 30 Lux de luz) e deixe-o explorar o aparelho pelo menos 5 min sob gravação neural. Determinar o limiar de fuga – intensidade de corrente mínima produzindo correr ou saltar. No presente estudo, entregar uma estimulação de 2500 Hz de alta frequência (largura de pulso: 100 µs; intervalo de pulso: 100 µs) para o colículo inferior em intervalos de 1 min, aumentando a intensidade de corrente em 20-50 µA passos até ratos mostraram escapar comportamento. Voltar o rato da gaiola em casa, limpar o campo aberto (solução de ácido acético 0,1%) e secá-lo Nota: A fim de comparar a eficácia da estimulação da TWS com o sistema tradicional de amarrados acima descrito o procedimento foi realizado utilizando ambos os sistemas. Elevada e mais labirinto Nota: plus-labirinto usado nesses experimentos foi feito de acrílico cinzento e consistia de dois braços abertos (50 cm comprimento x 10 cm de largura) e dois fecharam braços (50 cm comprimento x 10 cm de largura, com muros altos de 40 cm) que estendia uma pla central TForm elevada 50 cm acima do chão 16. Colocar o rato no centro do virado plus-maze para um braço aberto e deixe-o explorar livremente o aparelho sob gravação contínua durante 5 min. Gravar o número de entradas em, e o tempo gasto nos braços abertos e fechados ao longo de um período de 5 min. Retornar o rato para sua gaiola em casa, limpo (solução de ácido acético 0,1%) e seque o labirinto antes de cada teste Perfusão e histologia anestesiar o rato com xilazina/cetamina (150 mg/kg e 100 mg/kg, respectivamente; i.p.). Ligar a unidade de eletrodo implantado no cabo de estimulação e aplicar a estimulação elétrica (atual intensidade 50 µA, largura de pulso: 100 µs; intervalo de pulso: 100 µs) durante 90 s a fim de produzir uma pequena lesão ao redor da ponta do eletrodo. , Desconecte o cabo de estimulação e perfundir o animal através do ventrículo esquerdo com soro fisiológico, seguido por 200 mL de paraformaldeído 4% em tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,3 (para uma descrição detalhada, consulte referência 17 ). Remover o cérebro e mergulhá-lo para 4h no fixador fresco em 4 ° C. Certifique-se que a temperatura da câmara do criostato principal está a -20 ° C. Congelar o cérebro ao gelo seco e corte-os em 50 µm secções coronal usando um criostato serial. Mancha as seções com cresylviolet para localizar as posições das pontas do eletrodo, de acordo com o atlas por Paxinos e Watson 14.

Representative Results

Dados técnicos do TWS O sistema sem fio oferece 4 canais de gravação independente e canal 1 estimulação. Atividade extracelular foi pego pelo eléctrodo de núcleo único de gravação e repassada para o sinal de entrada de alta impedância do sistema sem fio. O sinal gravado foi (x200) pre-amplificado por um pré-amplificador de entrada diferencial, C.A.-acopladas e bandpass filtrada (sinal fixo de largura de banda, 500 Hz… 5 kHz) para gravar apenas multi-unidade atividade, porque no presente estudo o interesse principal era a atividade da unidade de registro e potenciais de campo não local. O principal-amplificador de ganho programável integrado oferece ganho ajustável-software para os quatro canais de gravação (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64). A cadeia de sinal completo do sistema sem fio oferecidos valores de ganho global de x200, x400, x800, x1600, x 3200, x6400 e x12800. Após a amplificação e a filtragem, o sinal analógico foi digitalizado por um conversor digital analógico, modulado em uma portadora de alta frequência e transmitido por um transceptor de rádio usando a faixa ISM de 2.4-2.5 GHz. O mesmo tipo de transceptor, utilizou-se do outro lado do caminho de transmissão. Este transceptor segundo foi conectado a um computador pessoal através de uma porta USB. O caminho de transmissão foi usado para transmissão de dados bidirecional para enviar os sinais gravados extracelulares do animal para o computador e vice-versa, os parâmetros de controle para amplificação de sinal e estimulação do computador para o animal. Usando o TWS, foi possível gravar a atividade cerebral de múltiplas unidades e modificar o comportamento do animal, estimulando o colículo inferior, enquanto o rato estava movendo-se livremente no campo aberto com êxito. O transceptor foi colocado até 5 m de distância do animal e foi conectado ao computador através de um USB port (ver Figura 2). Uma comparação entre as qualidades de sinal gravado rendeu com o amarrados e o sistema sem fios é demonstrado na Figura 5. A TWS registros multi-unidade atividade com uma qualidade de sinal similar como um sistema de gravação com fio. O microestimulador é um verdadeiro estimulador sem fio atualiza os parâmetros de estimulação em tempo real, ou seja, o sinal de estimulação, cujos parâmetros são definidos com o software TWS é passado para o eletrodo de estimulação conectado ao palco principal dentro de algumas milissegundos depois de apertar o botão de estimulação. Portanto, foi possível alterar os parâmetros de estimulação sem levar o animal fora da gaiola. Esta característica tem a vantagem que um pode minimizar o tempo para experimentos de estimulação. Um software TWS foi especialmente projetado para permitir o controle de todos os recursos do sistema sem fio (por exemplo, gravação e estimulação) através de interface gráfica de um usuário (Figura 3 e Figura 4). Para microestimulação, utilizou-se um sinal de estimulação que foi desenvolvido usando a interface gráfica do usuário do software TWS. O estimulador da TWS foi usado em um modo de estimulação equilibrado de corrente constante de carga. O padrão de estimulação foi enviado sem fio para o estimulador de corrente constante integrado na unidade sem fio cabeça de palco. Estimulação atual foi aplicada entre um microeléctrodo trabalho colocado em alvo de interesse (como por exemplo o colículo inferior no presente estudo) e um eletrodo de contador distante maior que serviu como o eléctrodo de terra ou referência do TWS. Dependendo da impedância do eletrodo de estimulação e conformidade de tensão do estimulador de corrente constante, é possível usar uma variedade de estimulação máxima atual de ±625 µA, embora um tanto inferior limite atual foi exigido nas experiências de presente. Aqui, bifásico carga equilibrada estimulação constante-atual foi usada com correntes de pico até 300 µA. Em caso de estimulação bifásica, o primeiro pulso é usado para obter o efeito fisiológico e o segundo pulso geralmente reverte processos eletroquímicos que ocorrem durante a estimulação de pulso18. O palco principal TWS fornece padrões de estimulação em tempo real definida através da interface gráfica do usuário do software TWS (ver Figura 4). O software TWS é dividido em três seções principais: (i) janela principal com controles para gravação e estimulação, uma janela de gerador de estímulo (ii) com todas as opções de configuração para os parâmetros do sinal de estimulação e uma janela do reprodutor (iii) para reproduzir o arquivos de dados gravados. A janela principal permite ao usuário exibir os sinais gravados de até 4 canais de gravação, definir o ganho para todos os canais e iniciar/parar a gravação dos sinais de exibido. Os dados do sinal são armazenados em um arquivo do disco duro do computador. O caminho do arquivo é definido no menu de configuração. Além dos parâmetros de gravação, a janela principal permite iniciar e parar o processo de estimulação. A estimulação constante atual que é passada através do eletrodo de estimulação no cérebro animal é exibida em tempo real na tela da janela principal. Os parâmetros do sinal de estimulação são pré-ajustados na janela de configurações de parâmetro de estímulo. É possível definir mono ou bifásico trens de pulso de estimulação e para definir a estimulação comumente usada todos os parâmetros de pulso, como por exemplo largura, amplitude de pulso, de pulso, tempo entre pulsos, etc. (para detalhes, ver Figura 4). A função do pulso de estimulação que resulta dos valores de parâmetro pré-selecionado é mostrada em uma exibição gráfica da janela do gerador de estimulação. O software TWS foi projetado de acordo com aspectos de usabilidade. A usabilidade do software é um factor essencial para garantir o bom andamento do experimento estimulação/gravação sem fio e um ambiente de trabalho seguro e confortável. Também ajuda a melhorar a reprodutibilidade do experimento. Dados de gravação unitárias e estimulação elétrica Extracelular multi-unidade atividade sucessivamente foi gravada no colículo inferior do eléctrodo implantado do mesmo usando o TWS e um sistema convencional de gravação amarrados. A Figura 5 mostra representativos dados brutos gravados usando ambos os sistemas, enquanto o animal se movia livremente em campo aberto. Comparação direta dos sinais sugere formas de onda de pico semelhante e os níveis de ruído (Figura 5A e 5B). Uma demonstração da forma spike é retratada na ‘e B’. Desde que os ratos não tentou remover o palco principal TWS após a cirurgia e durante os dias subsequentes, foi assumido que não interfere significativamente com os seus movimentos e não causar desconforto. Assim, usando o TWS, um problema comum em gravações amarrados de ratos foi evitada, tais como a remoção e mastigação dos conectores e cabos. Com efeito, ratos com o estágio de cabeça TWS foram capazes de explorar o campo aberto e mais labirinto (sEE 1 filme) expositoras normais cruzamentos, criação e grooming comportamentos. Além disso, os parâmetros de estimulação usados com o convencional sistema amarrado ou TWS evocou o mesmo resultado comportamental, escapar aqui o comportamento. A partir de 100 µA, a amplitude de corrente de estimulação foi aumentada passo a passo até o limite de fuga – mínima intensidade de corrente produzindo correr ou saltar – foi alcançado e o comportamento de fuga foi provocado. Os limites individuais de fuga de 4 ratos foram semelhantes quando usando ambos os sistemas (Figura 5). Figura 1: Microeletrodos TWS unidade (1) gravação único eletrodo/tetrode, eletrodo de estimulação (2), placa de conexão de fibra (3) eletrodo, cabos de conexão (4) flexível, fio terra (5), placa (6) conector, conector (7) masculino ou feminino para sistema TWS (A); TWS microeletrodos unidade ligada do pré-amplificador (8) e o porta (9); (B) pronto para ser anexado a uma armação estereotáxica (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Vista superior do palco TWS cabeça montado módulo (A) sem fonte de alimentação do acumulador. Total de dimensões: altura 12,5 m, profundidade de 24mm (19,3 mm + 4,7 mm), largura 22,1 mm, peso: 5,96 vista inferior g. (B) mostrando o conector de unidade de eletrodo; fonte de alimentação de acumulador, altura 9 mm, profundidade de 26 mm, largura de 20 mm, peso 6 g (C); uma visão geral dos componentes TWS usado para este teste: cabeça (1) unidade de palco com acumulador montado no crânio animal´s, unidade de (2) receptor conectado ao computador porta USB, software de TWS (3) (D); foto de um rato livremente movendo e mostrando o palco principal TWS conectado à unidade de microeletrodos implantados anteriormente (E) e software de TWS mostrando sinais gravados exemplares (F). O palco principal TWS fornece padrões de estimulação em tempo real definida através de interface gráfica do usuário do software TWS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: interface de usuário gráfica de software TWS, gravação de tela. O desempenho de gravação da TWS com um única gravação bipolar eletrodo, implantado no colículo inferior, é retratado na tela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: interface gráfica do usuário do TWS software. tela de estimulação (A) e especificações de parâmetro de estimulação (B). Parâmetros do sinal de estimulação (C) como a largura de pulso (PxW), amplitude de pulso (PxA), inter atraso pulso (IPD), tempo entre pulsos (TBP), pulso por trem (PPT) e o tempo entre trens (TBT) são ajustáveis através da interface gráfica do usuário do TWS software. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : Comparação qualitativa entre um sinal multi-unidade extracelularmente gravado com o TWS (A) e uma configuração de gravação com fio (B). Ambas as gravações foram obtidas da mesma TWS microeletrodos unidade (impedância 0.5MOhm) implantada no colículo inferior. A axial distância entre os dois contatos de eletrodo gravação foi aproximadamente 400 µm. A largura de banda de gravação do sistema com fio e o TWS foram idêntico (500 Hz… 5 kHz), os sinais foram amostrados com 40 kHz (com fio sistema) e 32 (TWS). Ambos os sistemas registrados multi-unidade atividade com uma qualidade de sinal semelhante. Não há nenhuma diferença clara em disparar taxas entre o TWS e gravações com fio. Forma de onda de potencial de ação do neurônio de ambas as gravações são mostrados na ‘e B’. Parâmetros de estimulação semelhantes eram necessários para 4 ratos atingir o limiar de fuga utilizando um sistema amarrado (TS) ou TWS (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Filme 1: Um rato exemplar exibindo comportamento exploratório normal durante o teste de labirinto mais A TWS permite que o animal entrar com os braços abertos e fechados sem fios tornando entrelaçado até no aparelho de teste, ainda é pequeno e leve o suficiente para que apenas minimamente interfere na tarefa em si. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Discussion

Apresentou-se aqui, um sistema sem fio amplamente acessível gravação e estimulação para Estudos eletrofisiológicos e comportamentais em animais movimentando-se livremente. A TWS foi validado em ensaios comportamentais usando o colículo inferior como um modelo de estrutura. A abordagem TWS tem várias vantagens sobre os já existentes. Em primeiro lugar, o sistema usa um único portátil TWS cabeça-palco equipado com um pré-amplificador e uma bateria recarregável, permitindo gravações de longo prazo estáveis para até 1 h com a mesma bateria e distância de operações sem fio de até 5 m. em segundo lugar, é o palco principal do TWS luz e compacto, pesando 12 g incluindo a bateria e foi desenvolvido para evitar o rato de remoção de fase de cabeça e mastigar os fios. Foi bem tolerado pelos animais desde nenhum impacto sobre o repertório comportamental de animal´s com e sem o TWS cabeça fase observou-se, tornando o sistema aplicável a um amplo conjunto de tarefas comportamentais. Em terceiro lugar, o sistema transmite em tempo real. Em quarto lugar, através da estimulação da atividade neural e gravação simultânea bidirecional, o sistema fornece uma ferramenta sofisticada para avaliar as relações causais entre os padrões de ativação cerebral específica e comportamento, assim, superar as deficiências de sistemas unidirecionais. Esta característica torna o método particularmente valioso para o campo da estimulação profunda do cérebro, que geralmente requer avaliação precisa, monitoramento e ajuste dos parâmetros de estimulação durante experimentos comportamentais a longo prazo. Finalmente, uma unidade de microeletrodos cronicamente implantável foi desenvolvida com gravação integrada, estimulação e eletrodo de referência que pode ser facilmente implantado durante uma cirurgia estereotáxica convencional. Deste ponto de vista, a TWS é um sistema integrado sem fios que aumenta a reprodutibilidade de experimentos de estimulação e gravação. A qualidade da gravação da TWS foi mostrada para ser similar à qualidade de gravação rendida com um sistema de gravação com fio comercialmente disponível (ver Figura 5).

É amplamente conhecido que a estimulação elétrica do colículo inferior em ratos provoca clara fuga comportamento caracterizado por correr ou saltar, que imita a reações de medo eliciada por desafios ambientais11,12, 13. Este comportamento foi induzido no presente estudo, estimulando o colículo inferior usando o TWS ou o tradicional sistema amarrado. Para testar a eficácia da estimulação do TWS, os limiares de fuga – mínima intensidade de corrente produzindo correr ou saltar – foram comparados usando ambos os sistemas. Ratos com o estágio de cabeça TWS são capazes de correr rapidamente, pulando e saindo do campo aberto, ou seja, Exibir comportamento de fuga típico, com maior liberdade de movimento. Importante, os limiares de fuga foram semelhantes em relação ao tradicional sistema amarrado. Juntos, um paradigma bastante desafiador foi usado para testar a resistência do TWS, que domina-lo em uma maneira hassle-livre.

A TWS também é adequado para experimentos de estimulação elétrica crônica, uma vez que a unidade de microeletrodos implantada permite uso crônico. A TWS permite ajustar os parâmetros de estimulação com precisão em uma maneira de detectar com precisão a frequência e a quantidade de estimulação atual que é eficaz para eliciar uma resposta comportamental. Além disso, o mesmo animal foi estimulado com o limite atual mesmo 3 dias depois e a mesma resposta comportamental desejada foi provocada. Isto sugere que o tecido ao redor da ponta do eletrodo de estimulação não foi danificado pela estimulação atual que normalmente requer maior estimulação atual amplitudes de estímulos repetidos para eliciar a mesma resposta comportamental.

Além disso, é possível reduzir significativamente o tempo experimental, porque o micro TWS-estimulador atualiza parâmetros de estimulação em tempo real quando o experimentador altera-las na interface gráfica do usuário. Para a necessidade de pesquisa pré-clínica, outros estimuladores elétricos19 costumava ser reprogramado para atualização de parâmetro de estímulo. Nesses casos, o aparelho é programado por amarrar o animal via cabo a uma unidade de programação. Isso não é necessário ao usar o TWS.

Finalmente, a bateria é fixada para o início da fase de cabeça TWS e eletricamente conectado ao palco principal através de um conector de ímã de dois pinos para fácil troca da bateria. A vantagem é que, durante o experimento, é possível trocar a bateria sem desligar o estágio de cabeça TWS da unidade do eletrodo implantado, que é muito mais confortável para o animal. Durante o presente estudo, nós usamos uma bateria cujo tempo de operação é de apenas 1h. No caso do experimento leva mais de 1 h, é recomendável ter uma bateria carregada adicional disponível. A TWS pode ser conectado a substituição de baterias recarregáveis com capacidade de (i) 230 mA para o tempo de operação de 1 h, ou (ii) 450 mA para aproximadamente tempo de operação de 2,5 h. Ambos os tipos de baterias podem ser totalmente recarregados em 15 min.

Em resumo, o presente estudo descreve a operação do TWS projetado para estimulação neural e gravação de livremente se comportando pequenos animais. Apresenta também um conjunto completamente integrado de unidade de microeletrodos implantável, palco principal, receptor e softwares. A qualidade da gravação sem fio e estimulação é semelhante ao que do amarrados gravação de sistema com a vantagem de ser mais confortável, mais leve e mais seguro para o animal. Portanto, TWS pode ser usado para substituir o sistema amarrado, desde que não se restringe a mobilidade do animal e fornece um método flexível para controlar a estimulação e gravação neural sob circunstâncias onde outras abordagens seria difícil ou impossível. Portanto, TWS pode ser uma ferramenta importante para investigar a atividade como elétrica em circuitos neurais definidos gera determinadas formas de comportamento, uma questão fundamental em neurociência.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma pesquisa de subvenção da Federação Alemã de Industrial pesquisa associações (AiF; número de concessão: KF2780403JL3).

Materials

Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 Thomas RECORDING GmbH AN001165 The Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 is a portable multichannel telemetry system with laptop computer, a preinstalled Microsoft Windows operating system and TWS control software. The TWS includes: low noise 4 channel pre– and programmable main amplifier with fixed bandwidth, single channel constant–current stimulator for application of biphasic current pulses, software programmable micro stimulator, implantable connector system and a basic head stage unit for mounting to an animal. The system is delivered with a transceiver with USB port connection for laptops or desktop personal computers, the control software running under Microsoft operating system Windows. The TWS system can be used for extracellular neural stimulation and recording in freely behaving small animals (e.g. rats, guinea pigs). This system can be adapted to be used in larger animals (e.g. primates) as well.
Software for Thomas Wireless System (TWS) Thomas RECORDING GmbH inlcuded in AN001165 The software for the Thomas wireless system is running under Microsoft Windows operating system and provides the graphical user interface (GUI) for the Thomas Wireless System (TWS). The TWS GUI offers complete control of the TWS functions 4 channel recording and 1 channel stimulation.
Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) Thomas RECORDING GmbH AN001132 Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS).
Recording tetrode specifications: tetrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, tetrode fiber outer diameter: 100µm, tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance: 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm, dimensions of the electrode can be specified by the end user
Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) Thomas RECORDING GmbH AN001118 Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS).
Recording electrode specifications: electrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, electrode fiber outer diameter: 80µm/250µm (please specify), tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance. 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm
Holder for electrode implantation Thomas RECORDING GmbH AN000838 Special bent metal rod for microelectrode implantation for standard electrode holders. The rod is used to hold an implantable electrode. The implantable electrode is fixed to the rod with special Thomas RECORDING water soluable glue (AN001080). (Electrode holder is not included)
Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/230mAh) Thomas RECORDING GmbH AN001208 Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 230mA for approximately 1h operation time. (size: 27mm x 20mm x 6mm, weight app. 6g)
Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/450mAh) Thomas RECORDING GmbH AN001209 Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 450mA for more than 1h operation time. (size: 48mm x 30mm x 4mm, weight app. 11g)
Accumulator charger for Thomas Wireless System (TWS) rechargable accumulator Thomas RECORDING GmbH AN001207 Mains powered charger for the Thomas Wirless System (TWS) rechargable accumulators (AN001209 and AN001209)
Water soluble glue Thomas RECORDING GmbH AN001080 Thomas RECORDING water soluble electrode glue is a specially selected product for use with implantable microelectrodes in neuroscientific research. Its unique properties ensure a rigid connection between electrode and mounting device although it is easily removable with warm water. The Thomas RECORDING water soluble electrode glue can be used out-of-the-box, without any time consuming preparation. Thomas RECORDING water soluble electrode glue is not harmful to humans, animals or the environment. Quantity: 1 box of 10 gramms
Miniature differential preamplifier Thomas RECORDING GmbH AN000329 The Miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2 is a 2-channel, differential input preamplifier that is designed for low noise recordings from excitable tissue. It is intended for extracellular recording in conjunction with the implantation of implantable microelectrodes for freely moving animal appliactions with the Thomas Wireless System (TWS). The 2-Channel Miniature Differential Preamplifier (MDPA-2) is connected to the implantable microelectrodes for providing the initial tenfold amplification stage. Ideally Thomas RECORDING quartz glass insulated platinum/tungsten electrodes are used to yield optimal recording results with high signal amplitudes and low noise levels. The MDPA-2 has additional common ground and reference electrode inputs.
Connection cable Thomas RECORDING GmbH AN000330 Connection cable to connect the Thomas Miniature differential preamplifier (MDPA-2) to a main amplifier and an accumulator power supply.
Rechargeable power supply for the miniature preamplifier Thomas RECORDING GmbH AN000328 Rechargeable accumulator power supply for the Miniature differential preamplifier (MDPA-2).
Accumulator charger (US) Thomas RECORDING GmbH AN000167 Accumulator charger for the power supply AN000328 (US mains power outlet conenctor)
Accumulator charger (EU) Thomas RECORDING GmbH AN000168 Accumulator charger for the power supply AN000328 (EU mains power outlet connector)
Differential preamplifier/main amplifier/bandpass filter Thomas RECORDING GmbH AN000677 TREC AC Main Amplifier (LabAmp-03) is a single-channel, differential main amplifier for neurophysiological applications (e.g. extracellular recording with microelectrodes). This Instrument is designed to work with the miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2. The single channel of the LabAmp-03 contains a high-gain, low-noise differential amplifier stage followed by low frequency and high-frequency filters. The amplifier has two different filter amplifiers, a single unit activity (SUA) filter –amplifier and a local field potential (LFP) filter amplifier, both are connected parallel in the signal path. Record Mode offers two levels of signal gain (x10, x100) in a first stage and 4 additional levels (x5, x10, x25 and x50) in a final amplifier stage. Each amplifier has different bandpass characteristics for single unit activity (SUA) 500Hz…20kHz and local field potentials (LFP) 0,1Hz…140Hz. An audio monitor and a window discriminator is integrated in the device. The LabAmp-03 has an integrated audio monitor with loudspeaker. This unit provides audio reproduction of electrophysiological signals. The unit combines an audio amplifier in a compact, rugged package. This is especially suited to monitoring neural firing and muscle contractions. The audio monitor input is internally connected to the SUA-Filter amplifier output. The LabAmp-03 is delivered with external power supply for a mains power operation voltage range of 100-240V AC/50-60Hz.
USB Oscilloscope Thomas RECORDING GmbH AN001096 USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. This 2-channel PC oscilloscope is perfect suitable for mobile use on a laptop and permanent installation in control cabinets, industrial equipment and many other applications where a small, lightweight and powerful oscilloscope is required. This oscilloscope is connected to the signal output of the main amplifier is for display of recorded extracellular activity during the implanation of the implantable microelectrodes for the Thomas Wireless System (TWS). The user can acquire the measurement data over the several data-interfaces directly on the PC with includes PC software.
Stimulus generator Multichannel Systems STG3008-FA Stimulus Generator for Current (STG) and Voltage Driven Stimulation fulfill three functions: current driven stimulation, voltage driven stimulation, controlling and timing. The STG is available with 2, 4 or 8 independet output channels. Featuring integrated isolation units for each output channel, the STG is able to provide any arbitrary waveform.
Cap protector for the electrode Thomas RECORDING GmbH AN001193 Protective cap for implantable electrode unit for the Thomas Wireless System
Surgical equipment Scissors, blunt-end forceps, spatulas, surgical clippers, dental drill, and cotton buds
Drugs and chemicals Isoflurane, xylocaine, tramadol hydrochloride (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Germany), dexpantenol eye salve (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Germany), 3% hydrogen peroxide, povidone-Iodine (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Germany) and 70% ethanol;
Fixation material including Stainless steel screws (BN650 M1.2×5; 4.7 mm ), acrylic resin (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germany), ultraviolet glue (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Germany) and cap protector (Thomas Recording GmbH, Giessen, Germany);
Additional material Gloves, heating pad, syringes, and physiological saline.
Small Animal Stereotaxic Instrument (SASI) Thomas RECORDING GmbH AN000287 The model should be chosen according to the animal (rat, guinea pig, monkeys, etc) used in the study
Video camera EverFocus EverFocus, model: EQ150
Open field Made of transparent or gray acrylic, having round shape measuring 40x40x40cm
Elevated plus maze Made of gray acrylic and consisted of two open arms (50 cm long x 10 cm wide) and two closed arms (50 cm long x 10 cm wide, with 40 cm high walls) that extended from a central platform elevated 50 cm above the floor.
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References

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Citer Cet Article
Melo-Thomas, L., Engelhardt, K., Thomas, U., Hoehl, D., Thomas, S., Wöhr, M., Werner, B., Bremmer, F., Schwarting, R. K. A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats. J. Vis. Exp. (129), e56299, doi:10.3791/56299 (2017).
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