무선, Vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 인터페이스
Summary
무선, 멀티 채널 신경 녹음 및 자유롭게 쥐 행동에 자극에 대 한 양방향 시스템 도입. 시스템은 가볍고 콤팩트, 따라서 animal´s 행동 레 퍼 토리에 최소한의 영향을 미치고. 또한,이 양방향 시스템 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 평가 하는 정교한 도구를 제공 합니다.
Abstract
Vivo에서 전기 생리학 두뇌 활동 및 밀리초 및 마이크로 미터 규모에 동작 사이의 관계를 조사할 수 있는 강력한 기술입니다. 그러나, 현재 방법 테더 케이블 녹음에 주로 의존 하거나만 녹음 또는 자극의 신경 활동, 하지만 같은 시간 또는 같은 대상에 단방향 시스템을 사용 합니다. 여기, 새로운 무선 양방향 장치 동시 멀티 채널 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 설명입니다. 시스템을 모두 전송 기록된 활동에 타겟이 될 수 있는 하나의 휴대용 머리 단계를 통해 작동 원격 기반 멀티 채널 소프트웨어를 사용 하 여 두뇌 자극에 대 한 시간. 머리 단계는 프리 앰프와 충전, 중요 한 것은 안정적인 장기 녹음 또는 최대 1 헤에 대 한 자극을 수 있도록, 머리 단계 소형 무게 12 g (배터리 포함) 이며, 따라서 animal´s는 최소한의 영향에 행동 레파토리, 방법 행동 작업의 광범위 한 세트에 적용 하 또한, 메서드는 신경 활동 및 행동에 두뇌 자극의 효과 측정 될 수 있다 동시에, 특정 한 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 평가 하는 도구를 제공 하는 주요 이점이 있다. 이 특징은 방법 특히 깊은 두뇌 자극, 정확한 평가, 모니터링 및 장기 행동 실험 동안 자극 매개 변수의 조정 수의 분야에 대 한 귀중 한. 열 등 한 colliculus 모델 구조를 사용 하 여 시스템의 적용 검증 않았습니다.
Introduction
신경 과학에 기본적인 질문은 정의 된 신경 회로에서 어떻게 전기 활동 행동의 특정 형태를 생성. Vivo에서 전기 생리학 기록 또는 동물 행동 특정 작업을 수행 하는 동안 뇌의 전기 활동을 자극 하는 도구를 제공 하는이 문제를 해결 하는 강력한 기술입니다. 그러나, 현재 시스템 자주 닿는 케이블 녹음1,2, 가능성이 이동성을 제한 하 고 방지 animal´s 행동 레 퍼 토리의 전체 식에 의존 합니다. 또한, 주로 단방향 시스템 사용 중3,,45 또는 자극6,7 신경 활동의 기록 하지만 하지 같은 시간 또는 같은 대상에 게 허용 특정 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 풀 게 곤란 한. 단지 몇 가지 무선, 양방향 시스템 비보에 준비에 대 한 현재 사용할 수 있습니다. 그러나, 그들은 일반적으로 무거운 (40-50 g) 두 명의 별도 휴대용 단위, 즉 머리 단계와 배터리 기반 전원 공급8,,910, 덜 그들을 렌더링에 대 한 연결 된 배낭 이루어져 유연한 자체 동작을 손질 하는 동안 예를 들어 케이블 단절의 위험을 증가. 상기 무선 시스템의 높은 재현성 실험 조건의 전체 ethologically 유효한 동작 동안 신경 활동의 완벽 한 통합된 개념을 얻으려고 삽입형 microelectrode 단위를 제공 합니다.
여기, 새로운 무선, vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 장치 도입. 토마스 무선 시스템 (TWS) 무대를 통해 단일 이동식 머리는 최대 4 개의 독립적인 녹음 채널을 사용 하 여 멀티 채널 활동을 전송할 수 있습니다 대상이 될 수 있습니다 실시간으로 전기 두뇌 자극에 대 한 작동 합니다. 또한, 만성 이식 microelectrode 단위는 TWS 호환 신경 자극과 녹음 수 있도록 개발 되었다. TWS 소프트웨어 그래픽 사용자 인터페이스, 녹음 및 자극에 대 한 또한 제공 됩니다. 이 연구 전체 장치의 유효성 검사 및 vivo에서 구현을 설명합니다.
TWS 시스템의 유효성을 검사 하기 위하여 명백한 행동 반응의 전기 자극에 의해 elicited 될 수 있기 때문에 열 등 한 colliculus 신경 구조를 대상으로 선정 되었다. 열 등 한 colliculus의 전기 자극 쥐, 경보, 옆 자세, 뒷면의 아치, 및 탈출 (비행) 동작 등에서 무조건된 ‘ 두려움 ‘ 처럼 행동 응답 elicits 널리 알려져 있습니다. 이 응답 패턴 인식된 유해한 이벤트, 공격 생존11,,1213에 위협 등 환경 문제에 의해 evoked 공포 반응을 모방 합니다. 그것은 그는 TWS를 진정한 도전을 제공 명확 하 고 명확한 행동을 이끌어내는 있게 되 고 간주 되었다.
Protocol
현재 유럽 지침에 따라 모든 프로토콜 및 실험 했다 (2010/63/EU) 지역 당국에 의해 승인 (Regierungspräsidium 기 센, 미스터 20/35 Nr.25/2015). 1. 동물 남성 성인 Wistar 쥐 (200-250 g) 순응 수 있도록 수술 전에 적어도 1 주일에 대 한 표준 실험실 조건 하에서 3-4의 그룹에 집. 이틀 후 수술, 쌍에서 집 쥐. 높은 아크릴 뚜껑과 단일 케이지를 커버. 기존의 뚜껑 금속 격자 임 플 란 트 갇혀 얻을 수 있습니다, 이후 만들어진 그들은 손상 및 이상 불안정 시간 될 위험이 증가 하지 마십시오. 2. 정위 적 수술 시작 하기 전에 수술, 구성 하 고 다음 장비 및 재료 준비: 받기 무 균 수술 장비 소독가 위, 무뚝뚝한 끝 집게, 주걱, 수술의 구성 클리퍼 스, 치과 드릴 및 목화 싹. 약물 및 화학 물질 isoflurane, xylocaine, tramadol 염 산 염, dexpantenol 눈 연 고, 3% 과산화 수소, povidone 요오드와 70% 에탄올 등. 기정 소재 스테인레스 스틸 나사, 아크릴 수 지, 자외선 접착제 및 모자 보호를 포함 하 여 얻기. 얻을 microelectrode 단위, (i) 녹음 단일 전극 구성 (석 영 유리 절연 플래티넘 텅스텐 microelectrode, 원추형 팁 모양, 외부 직경: 80 µ m, 원추형 팁, 1 kHz: 500 kOhm에서 임피던스) 또는 tetrode (석 영 유리 백 금/텅스텐 4 코어 microelectrode, 외경 절연: 100 µ m, 원추형 팁, 임피던스 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii)는 자극 전극 (백 금/이리듐 와이어 (90% 백 금, 리 듐 10%), 코어 직경 125µm, 외부 직경 150 µ m, 임피던스 < 10 kOhm) 백 금 철사 참조 전극 (샤프트 직경, 100 연락처 플레이트 및 (iii)에 연결 µ m; 그림 1A). 얻기 전극 홀더 microelectrode 단위에 수용 성 접착제로 붙어 하 고 사전에 기능 이상 h 2에 대 한 테스트 ( 그림 1B). 차동 앰프 구성 된 기존의 테더 링 시스템, 메인 앰프와는 대역 통과 필터 녹음에 대 한 앰프. 장갑, 난방 패드, 주사기, 그리고 생리 식 염 수 등 추가 자료 얻을. 얻을 홈 연습장 (L x h: 42 cm x 폭 26 c m x 38 c m x). 절차 참고: 전극 이식 isoflurane 마 취 기존의 정위 적 수술 하는 동안 수행 됩니다. 는 실험 장갑, 수술 용 마스크, 및 실험실 외 투를 입고는 확인 하십시오. 마 취 유도 실에서 동물을 배치 시작 (isoflurane 4-5%, 산소 흐름 1 L/min, 기간 ~ 5 분). 깊은 마 취를 확인 하는 집게와 (꼬리와 발가락 반사) 반사의 손실에 대 한 테스트. 정위 적 프레임의 위 니 바 주위 고정 마 취 마스크에 동물의 머리를 놓고 마 취를 조정 (isoflurane 2-3%, 산소 흐름 0.7-0.8 L/min). 수정 가로 정렬 동물 ' 귀 바와 위 니 바를 사용 하 여 정위 적 장치에 s 머리 외과 분야 수술 또는 한가 위를 사용 하 여 면도 하 고 povidone 요오드 소독. 저체온증을 방지 하 고 건조에서 그들을 방지 하기 위해 dexpantenol 눈 연 고로 눈을 치료 생리대에 동물을 배치. Xylocaine 주사 (0.3-0.4 mL, 피하, 사우스 캐롤라이나) 수술 분야의 센터에서. 다시 반사의 손실에 대 한 테스트. 노출 두개골 수술 필드 중간 메스와 작은 절 개 (1.5 c m)를 확인 합니다. 부드럽게 피부를 분리, 집게가 위, 주걱을 사용 하 여 잔여 조직을 제거. 과산화 수소 코팅 면봉을 사용 하 여 두개골을 신중 하 게 청소. 스테인리스 나사 고정을 위한 두개골에 4-5 작은 구멍 (4.7 m m)을 드릴. Microelectrode 단위/전극 홀더는 프리 앰프에 연결 하 고 정위 적 micromanipulator 연결 ( 그림 1B 및 1 C). 사용 하는 동물에 따라 뇌 아틀라스에서 좌표를 사용 하 여 대상 영역 위에 두개골에 구멍 (약 7mm)을 드릴. 현재 연구에서 겨냥 bregma 참조로 봉사와 함께 다음과 같은 좌표를 사용 하 여 열 등 한 colliculus 전극 팁 위치: 앞쪽/후부, − 8.8 m m; 중간/측면, 1.5 m m; 고 등/복 부, 3.5 m m 14. 면봉으로 어떤 혈액 흡수. 전극 팁 대상 영역에 도달 때까지 세로로 microelectrode 단위 소개. 접지 케이블 따라 스테인레스 스틸 나사와 피부 아래 위치. 모니터 활동 스파이크 신중 하 게 대상 구조에 활성 뉴런의 영역에 도달할 때까지 micromanipulator 전극 위치를 조정 하 고 스파이크 정렬에 대 한 적합 한 신호 대 잡음 비율 신경 활동을 감지. 자외선 접착제로 두개골에 microelectrode 단위를 수정 하 고 연락처 플레이트와 아크릴 수 지와 나사 커버. 생리 식 염 수 (1 mL i.p.) 및 (25 mg/kg, 사우스 캐롤라이나) 탈수를 방지 하 여 수술 후 무 통을 각각 보장 tramadol 주사. 분리를 브러시를 사용 하 여 전극 홀더에서 microelectrode 단위는 물에 젖 었. 정지 마 취는 신중 하 게 정위 적 프레임에서 쥐를 제거 합니다. 프리 앰프는 microelectrode에서 분리 장치와 Microelectrode 단위 이식에 모자 보호를 연결 하 고 실험 절차 동안에 분리. 수술 후 두 번째 날부터 집-감 금 소에 있는 쌍에 동물 유지. 모니터 동물 매일 가능한 상처 감염, 체중, 건강 상태, 그리고 일반적인 동작 수술 후 7 일 동안. 이 복구 기간 후 vivo에서 전기 생리학 및 행동 실험 수행. 참고: 수술 60-90 분 사이 정도 야. 수술, 동안 꼬리 영화 반사 지속적으로 모니터링 해야 하 고 마 취, 필요 하다 면 조정. 3. Vivo에서 전기 생리학 장비 및 절차 참고: Electrophysiological 녹음 및 자극은 TWS를 사용 하 여 수행 됩니다. 얻기는 통합된 프리 앰프와 연결 된 배터리 머리 무대 (4 녹음 채널, 아날로그 입력된 범위를 기록: 0-12 mV pk-pk; 자극 출력: ±625 µ A; L x W x h: 24 x 22 m m x 12 m m; 무게: 6 g 배터리, 배터리; 12 g 없이 배터리 실행 시간 최대 1 시간). 이 머리 단계는 미니어처 multipole 커넥터 ( 그림 2)를 통해 이식된 microelectrode 단위에 직접 연결 되어 있어야 적합. 얻기 배터리 (리튬 이온 누 산 기, 3.7-4.2 V DC, 230 mAh, 27 m m x 20 m m x 6 m m, 1 시간 작업 시간) 머리 단계 ( 그림 2C) 위에 탑재. 필요한 경우 450의 용량 교체 충전식 배터리를 사용 하 여 약 2.5 h 작업 시간에 대 한 mA. 녹색 빛이 오는 것 머리 단계에서 배터리를 연결 하는 동안 확인 얻기 트랜시버 (수신기-송신기) 표준 USB 포트를 통해 개인용 컴퓨터에 연결 하 고 최대 5 m ( 그림 2E)에 대 한 무선 작업을 수 있습니다. 얻을 전기 자극 및 신경 활동의 기록을 위한 TWS 소프트웨어로 개인용 컴퓨터 ( 그림 3 및 그림 4 ). 얻을 테더 프리 앰프와 수술 중에 사용 데이터 수집 시스템 (2.1.5 항목 참조) 녹음, 및 자극에 대 한 자극 발생기에 TWS의 efficaciousness를 비교 하기 위해 깨어 쥐 수술 후 1 주일. 참고: 전기 자극 제공 하며 두 시스템을 사용 하 여 동일한 이식된 microelectrode 단위에서 단일 뉴런에서 세포 외 활동 기록 됩니다. (현재 강도, 펄스 및 주파수) 자극 매개 변수는 대상 두뇌 지역에 따라 각 동물에 조정 되어야 한다. 현재 연구, 150-250 µ A에서에서 2500 Hz 전류는 열 등 한 colliculus 자극 하 사용 되었다. 행동 분석 실험 참고: 트랜시버 및 동물 머리 단계 사이 아무 금속 장벽 도입, 일단는 TWS는 행동 작업의 광범위 한 세트에 적용. 모범적인 행동 테스트로 측정 일반 행동 활동의 하 고는 상승에 플러스 미로, 설치류 15 불안 같은 행동을 평가 하는 표준 테스트에 대 한 오픈 필드에서 사용 되었다. 비디오 카메라 오픈 필드 위의 중앙에서 배치 되었고 행동 녹음에 대 한 미로 플러스 상승. 행동 테스트 하기 전에 3 일 연속 (5 분 매일)에 각 동물을 처리. 각 처리 기간 전에 머리 무대 이전 이식 microelectrode 단위에 배터리를 연결 합니다. 어떤 기록 또는 처리 하는 동안 자극을 수행 하지 마십시오. 오픈 필드 쥐 오픈 필드의 중앙에 배치 (40 cm x 40 cm x 40 cm; ~ 30 럭 스 빛 레드) 신경 기록에서 적어도 5 분 동안 장치를 탐구 하도록. 탈출 임계값-생산 실행 또는 최소 전류 강도 결정 합니다. 현재 연구에서 높은 주파수 2500 Hz 자극 제공 (펄스 폭: 100 µs; 펄스 간격: 100 µs) 20-50 µ A에 의해 현재 강도 증가 하는 1 분 간격으로 열 등 한 colliculus 하 쥐 보여줄 때까지 단계 행동 탈출. 쥐의 집 케이지를 반환, 오픈 필드 (0.1% 초 산 용액)을 청소 하 고 그것을 건조 참고: 절차는 위에서 설명한 전통적인 테더 시스템과 TWS의 자극 효능을 비교 하기 위해 수행한 두 시스템을 사용 하 여. 미로 플러스 상승 참고: 플러스-미로이 실험에 사용 된 회색 아크릴으로 만든 고 두 팔을 이루어져 (50 cm 10 c m x 길이) 두 팔을 폐쇄 (50 cm 긴 x 10 c m 폭 40 c m 높은 벽)는 중앙 pla에서 확장 tform 바닥 16 위에 50cm 상승. 오픈 팔 쪽으로 플러스 미로 연결의 중심에 쥐를 놓고 5 분 동안 계속된 녹음 아래 기구를 자유롭게 탐험을 , 항목의 수를 기록 하 고 5 분 동안 열리고 닫힌 무기에 소요 된 시간. 쥐의 집 감 금 소, 깨끗 한 (0.1% 초 산 용액)를 반환 하 고 각 테스트 전에 미로 건조 관류 및 조직학 Anesthetize xylazine/마 취 제와 쥐 (150mg/kg, 100 mg/kg, 각각; i.p.). 이식된 전극 단위 자극 케이블을 연결 하 고 전기 자극을 적용 (현재 강도 50 µ A, 펄스 폭: 100 µs; 펄스 간격: 100 µs) 90 동안 전극 팁 주위 작은 병 변을 생성 하기 위하여 s. 자극 케이블을 분리 하 고 생리 식 염 수 200 mL의 0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.3에에서 4 %paraformaldehyde 뒤와 좌 심 실을 통해 동물 perfuse (에 대 한 자세한 설명은 참조 17 ). 두뇌를 제거 하 고 4에서 신선한 정착 액에 4 시간 담가 ° c. 확인 주요 cryostat 챔버의 온도-20 ° c. 드라이 아이스에 머리를 고정 하 고 50 µ m 직렬 코로나 섹션으로는 cryostat를 사용 하 여 그들을 잘라. Paxinos와 왓슨 14 아틀라스에 따라 전극 팁의 위치를 찾습니다 하기 위해 cresylviolet와 섹션을 얼룩.
Representative Results
TWS 기술 데이터 무선 시스템 4 독립적인 녹음 채널 및 1 자극 채널을 제공합니다. 세포 외 활동 기록 싱글 코어 전극으로 뽑 힐 되었고 무선 시스템의 높은 임피던스 신호 입력에 전달. 기록 된 신호는 미리 증폭된 (x200)는 AC 커플링, 차동 입력된 프리 앰프와 대역 통과 필터링 (고정된 신호 대역폭, 500 Hz… 5 kHz) 때문에 현재 연구에 주요 관심 기록 단위 활동을 로컬 필드 전위만 멀티 유닛 활동을 기록 하. 통합된 프로그래밍 가능 이득 주 증폭기 4 녹음 채널 (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64)에 대 한 소프트웨어 조정 가능한 이득을 제공합니다. X200, x400, x800, x1600, 3200, x의 전반적인 이득 값을 제공 하는 무선 시스템의 완벽 한 신호 체인 x6400와 x12800. 증폭 및 필터링, 후 아날로그 신호 아날로그 디지털 변환기를 의해 디지털화, 고주파 캐리어에 변조 되었고 라디오 트랜시버 2.4-2.5 g h z ISM 대역을 사용 하 여 전송. 같은 트랜시버 종류의 전송 경로에 사용 되었다. 이 두 번째 트랜시버는 USB 포트를 통해 개인용 컴퓨터에 연결 되었다. 전송 경로 신호 증폭 및 동물에 컴퓨터에서 자극에 대 한 변수를 제어 컴퓨터와 반대로 동물에서 세포 외 기록 된 신호를 보낼 양방향 데이터 전송을 위해 사용 되었다. TWS를 사용 하 여 multi-unit 두뇌 활동을 기록 하 고 열 등 한 colliculus 쥐 오픈 필드에서 자유롭게 이동 했다 하는 동안 자극 하 여 동물의 행동을 수정이 가능 했다. 트랜시버 최대 5 미터 거리에 있고 동물을 배치 했다,는 USB 통해 컴퓨터에 연결 된 포트 ( 그림 2참조). 기록 된 신호 특성의 비교는 곁으로 굴복 하 고 무선 시스템은 그림 5에서 설명 된다. TWS 유선된 녹음 시스템으로 유사한 신호 품질 멀티 유닛 활동을 기록합니다. 마이크로-자극 자극 매개 변수 실시간으로, 즉 자극 신호, 매개 변수를 가진 TWS 소프트웨어 정의 업데이트 하는 진정한 무선 자극 일부 내 머리 단계에 연결 된 자극 전극에 전달 되는 자극 버튼을 누른 후 밀리초입니다. 따라서, 그것은 감 금 소에서 동물을 복용 하지 않고 자극 매개 변수를 변경할 수 했다. 이 기능은 하나 자극 실험에 대 한 시간을 최소화할 수 있는 장점이 있습니다. TWS 소프트웨어 그래픽 사용자 인터페이스 (그림 3 및 그림 4)를 통해 (녹음 및 자극) 무선 시스템의 모든 기능 제어를 허용 하도록 특별히 설계 되었습니다. 마이크로-자극, 자극 신호 사용 되었다 TWS 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스를 사용 하 여 개발 되었다. TWS의 자극 충전 균형된 정 전류 자극 모드에서 사용 되었다. 자극 패턴 머리 단계 무선 단위에 통합 하는 정 전류 자극 기에 무선으로 전송 되었습니다. 현재 자극 (예를 들면 현재 연구에 열 등 한 colliculus) 관심과 TWS의 지상 또는 참조 전극으로 더 큰 먼 카운터 전극의 대상에 배치 작업 microelectrode 사이 적용 되었다. 자극 전극 임피던스 및 전압 정 전류 자극 기의 준수에 따라 비록 훨씬 낮은 전류 임계값은 현재 실험에 필요한, ±625 µ A의 최대한 자극 전류 범위를 사용 하 여 가능 하다. 여기, 복 형 충전 균형된 정 전류 자극 300 µ A까지 피크 전류와 함께 사용 되었다. 복 형 자극, 경우 첫 번째 펄스 생리 적 효과 유도 하는 데 사용 하 고 두 번째 펄스는 일반적으로 자극 펄스18동안 발생 하는 전기 화학적 인 과정을 반전 합니다. TWS 머리 단계 공급 TWS 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 설정 실시간으로 자극 패턴 ( 그림 4참조). TWS 소프트웨어 세 가지 주요 섹션으로 나누어져 있습니다: (i) 자극 신호 매개 변수 및 재생 (iii) replayer 창에 대 한 모든 설정 옵션 기록 및 자극, (ii) 자극 발생기 창에 대 한 컨트롤과 메인 윈도우는 기록 된 데이터 파일입니다. 메인 윈도우를 사용 하면 최대 4 녹음 채널의 기록된 신호 표시, 모든 채널에 대 한 이득 설정 및 표시 신호 기록 시작/중지 수 있습니다. 신호 데이터는 컴퓨터 하드 디스크에 있는 파일에 저장 됩니다. 파일 경로 구성 메뉴에서 설정 됩니다. 녹음 매개 변수 게다가 주 창 시작 하 고 자극 프로세스를 중지할 수 있습니다. 지속적인 자극 현재 동물 뇌에 자극 전극을 통해 전달 되는 메인 윈도우 화면에 실시간으로에서 표시 됩니다. 자극 신호 매개 변수는 자극 매개 변수 설정 창에서 사전 조정. 그것은 모노-또는 복 형 자극 펄스 트레인을 정의 하 고 일반적으로 사용 되는 모든 자극 펄스 매개 변수를 설정 처럼 예를 들어 펄스 폭, 펄스 진폭, 펄스, 등 (자세한 내용은 그림 4참조) 시간 수 있습니다. 미리 선택 된 매개 변수 값에서 발생 하는 자극 펄스 기능 자극 발생기 창에서 그래픽 디스플레이에 표시 됩니다. TWS 소프트웨어는 사용성 측면에 따라 설계 되었다. 소프트웨어의 유용성 무선 자극/녹음 실험 및 안전 하 고 편안한 작업 환경의 부드러운 진행을 보장 하는 필수적인 요소 이다. 또한 실험의 재현성을 향상 도움이 됩니다. 단일 단위 기록 데이터 및 전기 자극 세포 외 멀티 유닛 활동은 TWS 기존의 테더 기록 시스템을 사용 하 여 동일한 이식된 전극에서 열 등 한 colliculus에 연속적으로 기록 되었다. 그림 5 는 동물은 오픈 필드에서 자유롭게 이동 하는 동안 두 시스템을 사용 하 여 기록 하는 대표적인 원시 데이터를 보여 줍니다. 신호의 직접적인 비교 제안 유사한 스파이크 파형 및 잡음 레벨 (그림 5A 와 5B). 스파이크 형태로의 데모는 A에 묘사 된 ‘와 B’. 때문에 쥐 수술 후 및 연속적인 일 동안 TWS 머리 단계를 제거 하는 시도 하지 않았다, 그것은 그들의 움직임을 크게 방해 하지 않았다 하 고 불편을 발생 하지 않았다 간주 되었다. 따라서,는 TWS를 사용 하 여 쥐의 곁된 녹음에서 일반적인 문제 제거 등 피해와 커넥터 및 케이블의 씹는 했다. 실제로, 쥐 TWS 머리 무대와 벌판을 찾아보기 수 있었다 고 미로 (s 플러스ee 영화 1) 전시 일반 횡단, 양육 하 고 동작을 손질. 또한, TWS 또는 기존의 테더 링된 시스템으로 사용 되는 자극 매개 갖는 동일한 행동 결과, 여기 동작을 탈출. 100 µ A에서 시작, 자극 전류 진폭은 단계적으로 증가 되었다 최소 현재 강도 생산 실행 하거나 점프-탈출 임계값에 도달 했습니다 때까지 탈출 행동을 elicited. 4 쥐의 개별 탈출 임계값 (그림 5C) 두 시스템을 사용 하는 경우 유사 했다. 그림 1: TWS microelectrode 장치 (1) 기록 단일 전극/tetrode, (2) 자극 전극, 전극 (3) 섬유 연결 보드, (4) 유연한 연결 케이블, (5) 접지 와이어, (6) 커넥터 보드, (7) 남성 또는 여성 커넥터 TWS 시스템 (A); TWS microelectrode 단위 연결 (8) 프리 앰프와 홀더 (9); (B) stereotaxic 프레임 (C)에 연결 될 준비가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : TWS 머리 무대의 최고 보기는 누 산 기 전원 공급 장치 없이 모듈 (A)를 탑재. 총 크기: 높이 12.5 m, 깊이 24 mm (19.3 m m + 4.7 m m), 너비 22.1 m m, 중량: 5.96 g., 하단 보기 (B) 표시 전극 단위 커넥터; 누 산 기 전원 공급 장치, 높이 9 mm, 깊이 26 m m, 폭 20 m m, 무게 6 g (C); 이 테스트에 사용 되는 TWS 부품의 개요: (1) 머리 누 산 기 animal´s 두개골, USB 포트, (3) TWS 소프트웨어 (D); 컴퓨터에 연결 하는 트랜시버 (2) 단위에와 단위 단계 자유롭게 이동 및 TWS 머리 무대를 보여주는 쥐의 사진 microelectrode 단위 이전 이식 (E) 및 TWS 소프트웨어 보여주는 모범적인 기록 된 신호 (F)에 연결. TWS 머리 무대 TWS 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 설정 실시간으로 자극 패턴을 제공 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: TWS 소프트웨어 그래픽 사용자 인터페이스, 화면 녹화. 열 등 한 colliculus 이식 단일 바이 폴라 기록 전극와 TWS의 녹음 성능은 화면에 묘사 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: TWS 소프트웨어 그래픽 사용자 인터페이스. 자극 화면 (A) 그리고 자극 매개 변수 사양 (B). 펄스 폭 (PxW), 펄스 진폭 (PxA) 같은 자극 신호 매개 변수 (C) 인터 펄스 지연 (IPD), 펄스 (TBP), 기차 (PPT)와 열차 (TBT) 사이 시간 당 펄스 사이의 시간 TWS 소프트웨어 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 조정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : Multi-unit 신호 사이의 질적 비교 기록 extracellularly TWS (A)와 유선된 녹화 설정 (B). 두 기록에 열 등 한 colliculus 이식 같은 TWS microelectrode 장치 (임피던스 0.5MOhm)에서 얻은 했다. 두 기록 전극 접촉 사이 축 거리는 약 400 µ m 이었다. 유선된 시스템 및는 TWS의 녹화 대역폭은 동일 (500 Hz… 5 kHz), 신호 40 kHz (유선 시스템) 및 32 kHz (TWS) 샘플링 된. 두 시스템 모두 비슷한 신호 품질 멀티 유닛 활동 기록. TWS 유선된 녹음 사이 요금 발사에 분명 차이가 있다. A에서 두 녹음에서 신경 세포의 활동 전위 파형 표시 됩니다 ‘와 B’. 유사한 자극 매개 변수 테더 시스템 (TS)를 사용 하 여 탈출 임계값에 도달을 4 쥐를 위해 필요 했다 또는 TWS (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 영화 1: 플러스 미로 테스트 하는 동안 일반적인 탐구 행동 하는 모범 쥐 TWS 전선 엃 혀 있었습니다 지 고 테스트 장치에 아직 작은 고 작업 자체에 최소한 방해는 충분히 빛 없이 열리고 닫힌 팔을 입력 동물 수 있습니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
Discussion
여기, 광범위 하 게 액세스할 수 있는 무선 기록 및 자극 시스템 자유롭게 동물 이동 electrophysiological 및 동작 연구 제시 했다. TWS 열 등 colliculus 모델 구조를 사용 하 여 분석 하는 행동 실험에 확인 되었습니다. TWS 접근 기존 것 들 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 시스템 사용 하 여 단일 휴대용 TWS 머리-무대는 프리 앰프와 같은 배터리와 함께 최대 1 시간에 대 한 안정적인 장기 녹음 및 무선 작업 거리 최대 5 m. 둘째에 대 한 충전, TWS 머리 단계는 빛과 컴팩트, 12 g 배터리 포함 무게 그리고 머리 단계를 제거 하 고 철사를 씹는에서 쥐를 방지 하기 위해 개발 되었다. 그것은 함께 animal´s 행동 레 퍼 토리에 영향을 주지 않습니다 이후 동물에 의해 잘 용납 되었다 고는 TWS 없이 머리 단계 관찰 되었다, 행동 작업의 광범위 한 세트에 적용 되는 시스템을 만들기. 셋째, 시스템 실시간으로 전송합니다. 넷째, 양방향 동시 녹음 및 신경 활동의 자극을 통해 시스템 특정 두뇌 활성화 패턴 및 따라서 단점을 극복 하는 행동 사이의 인과 관계를 평가 하는 정교한 도구를 제공 합니다. 단방향 시스템. 이 특징은 방법 특히 일반적으로 정확한 평가, 모니터링 및 장기 행동 실험 동안 자극 매개 변수 조정 요구 한다 깊은 두뇌 자극의 분야에 대 한 귀중 한. 마지막으로, 만성 이식 microelectrode 단위는 통합 녹음, 자극 및 기존의 stereotaxic 수술 중 쉽게 이식 될 수 있는 참조 전극으로 개발 되었다. 이 관점에서는 TWS 자극 및 기록 실험의 재현성을 증가 하는 통합된 무선 시스템입니다. TWS의 녹음 품질 비슷합니다-상용 유선된 녹음 시스템으로 나왔고 녹음 품질을 표시 했다 ( 그림 5참조).
그것은 널리 알려져 쥐에서 열 등 한 colliculus의 전기 자극 elicits 탈출 행동 특징 실행 하거나 점프, 반응 환경 문제11,12,에 의해 이끌려 두려움을 분명 13. 이 문제는 TWS 또는 전통적인 속박 되 시스템을 사용 하 여 열 등 한 colliculus 자극 하 여 현재 연구에서 유도 했다. TWS의 자극 효능을 테스트 하려면 이스케이프 임계값-최소 현재 강도 생산 실행 하거나 점프-두 시스템을 사용 하 여 비교 했다. TWS 머리 무대와 쥐는 신속 하 게 실행할 수 있는, 점프 하 고 오픈 필드 등반, 즉, 움직임의 더 대단한 자유와 전형적인 탈출 행동를 표시. 중요 한 것은, 탈출 임계값 전통적인 속박 되 시스템에 비해 유사 했다. 함께, 오히려 도전적인 패러다임 번거로움 무료 방식으로 마스터 TWS의 탄력성을 테스트에 사용 되었다.
TWS는 또한 만성 사용을 허용 하는 microelectrode 단위 이식 이후 만성 전기 자극 실험에 적합 합니다. TWS는 주파수와 현재 효과적인 행동 반응을 유도 하는 자극의 양을 정확 하 게 감지 하는 방법에 매우 정확 하 게 자극 현재 매개 변수를 조정 수 있습니다. 또한, 같은 동물 같은 전류 임계값으로 자극 했다 3 일 후와 같은 원하는 행동 응답을 elicited. 이 일반적으로 같은 행동 반응을 유도 하기 위해서는 반복된 stimulations와 현재 진폭 증가 자극을 요구 하는 자극 전류에 의해 자극 전극 팁 주위 조직 손상 되지 했다 나왔다.
또한, 그것은 TWS 마이크로-자극 기는 실험 그래픽 사용자 인터페이스에 그들을 변경 될 때 실시간으로 자극 매개 변수를 업데이트 하기 때문에 실험 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 다른 전기 자극 제19 자극 매개 변수 업데이트에 대 한 재설정을 전 임상 연구 필요를 위해 사용. 이러한 경우에는 장치 프로그래밍 장치에 케이블을 통해 동물을 밧줄로 매 여 프로그래밍 됩니다. 이 TWS를 사용 하는 경우 필요 하지 않습니다.
마지막으로, 배터리가 TWS 머리 무대의 최고와 전기적으로 연결 된 배터리 쉽게 교환 위한 2 핀 자석 커넥터를 통해 머리 무대에 고정 됩니다. 장점은 실험 기간 동안 그것은 훨씬 더 편안 하 게 동물 이식된 전극 단위에서 TWS 머리 단계를 분리 하지 않고 배터리를 변경할 수는. 현재 연구 기간 동안 우리는 누구의 작업 시간은 1 시간 배터리를 사용 합니다. 실험 1 시간 보다 오래 걸리는, 경우에 사용할 수 있는 추가 충전된 배터리를가지고 두는 것이 좋습니다. TWS 1 h 작업 시간에 대 한 (i) 230 mA 또는 (ii) 450 약 2.5 h 작업 시간에 대 한 엄마의 용량 교체 충전식 배터리를 연결할 수 있습니다. 두 종류의 배터리는 15 분에 완전히 재충전 될 수 있다.
요약 하자면, 현재 연구는 TWS 신경 자극을 위해 디자인 하 고 자유롭게 행동 하는 작은 동물에서 녹음 작업을 설명 합니다. 삽입형 microelectrode 단위, 머리 무대, 수신기와 소프트웨어의 완전히 통합 된 세트도 제공 됩니다. 무선 기록 및 자극의 품질은 비슷합니다 그는 곁의 더 가벼운 편안 하 게 하 고 동물에 안전의 장점과 시스템 기록. 따라서, TWS 어디 다른 접근 것이 어렵거나 불가능 한 동물의 이동성을 제한 하지 않는 자극과 신경 녹음 상황을 제어 하는 유연한 방법을 제공 합니다 이후 테더 시스템을 대체 하 사용할 수 있습니다. 따라서, TWS 행동 신경 과학에 있는 기본적인 질문의 특정 형태를 생성 하는 정의 된 신경 회로에서 어떻게 전기 활동을 조사 하는 중요 한 도구가 될 수 있습니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 산업 연구 협회의 독일 연맹에서 부여 연구에 의해 지원 되었다 (AiF; 번호 부여: KF2780403JL3).
Materials
| Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 | Thomas RECORDING GmbH | AN001165 | The Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 is a portable multichannel telemetry system with laptop computer, a preinstalled Microsoft Windows operating system and TWS control software. The TWS includes: low noise 4 channel pre– and programmable main amplifier with fixed bandwidth, single channel constant–current stimulator for application of biphasic current pulses, software programmable micro stimulator, implantable connector system and a basic head stage unit for mounting to an animal. The system is delivered with a transceiver with USB port connection for laptops or desktop personal computers, the control software running under Microsoft operating system Windows. The TWS system can be used for extracellular neural stimulation and recording in freely behaving small animals (e.g. rats, guinea pigs). This system can be adapted to be used in larger animals (e.g. primates) as well. |
| Software for Thomas Wireless System (TWS) | Thomas RECORDING GmbH | inlcuded in AN001165 | The software for the Thomas wireless system is running under Microsoft Windows operating system and provides the graphical user interface (GUI) for the Thomas Wireless System (TWS). The TWS GUI offers complete control of the TWS functions 4 channel recording and 1 channel stimulation. |
| Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) | Thomas RECORDING GmbH | AN001132 | Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS). Recording tetrode specifications: tetrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, tetrode fiber outer diameter: 100µm, tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance: 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm, dimensions of the electrode can be specified by the end user |
| Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) | Thomas RECORDING GmbH | AN001118 | Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS). Recording electrode specifications: electrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, electrode fiber outer diameter: 80µm/250µm (please specify), tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance. 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm |
| Holder for electrode implantation | Thomas RECORDING GmbH | AN000838 | Special bent metal rod for microelectrode implantation for standard electrode holders. The rod is used to hold an implantable electrode. The implantable electrode is fixed to the rod with special Thomas RECORDING water soluable glue (AN001080). (Electrode holder is not included) |
| Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/230mAh) | Thomas RECORDING GmbH | AN001208 | Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 230mA for approximately 1h operation time. (size: 27mm x 20mm x 6mm, weight app. 6g) |
| Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/450mAh) | Thomas RECORDING GmbH | AN001209 | Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 450mA for more than 1h operation time. (size: 48mm x 30mm x 4mm, weight app. 11g) |
| Accumulator charger for Thomas Wireless System (TWS) rechargable accumulator | Thomas RECORDING GmbH | AN001207 | Mains powered charger for the Thomas Wirless System (TWS) rechargable accumulators (AN001209 and AN001209) |
| Water soluble glue | Thomas RECORDING GmbH | AN001080 | Thomas RECORDING water soluble electrode glue is a specially selected product for use with implantable microelectrodes in neuroscientific research. Its unique properties ensure a rigid connection between electrode and mounting device although it is easily removable with warm water. The Thomas RECORDING water soluble electrode glue can be used out-of-the-box, without any time consuming preparation. Thomas RECORDING water soluble electrode glue is not harmful to humans, animals or the environment. Quantity: 1 box of 10 gramms |
| Miniature differential preamplifier | Thomas RECORDING GmbH | AN000329 | The Miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2 is a 2-channel, differential input preamplifier that is designed for low noise recordings from excitable tissue. It is intended for extracellular recording in conjunction with the implantation of implantable microelectrodes for freely moving animal appliactions with the Thomas Wireless System (TWS). The 2-Channel Miniature Differential Preamplifier (MDPA-2) is connected to the implantable microelectrodes for providing the initial tenfold amplification stage. Ideally Thomas RECORDING quartz glass insulated platinum/tungsten electrodes are used to yield optimal recording results with high signal amplitudes and low noise levels. The MDPA-2 has additional common ground and reference electrode inputs. |
| Connection cable | Thomas RECORDING GmbH | AN000330 | Connection cable to connect the Thomas Miniature differential preamplifier (MDPA-2) to a main amplifier and an accumulator power supply. |
| Rechargeable power supply for the miniature preamplifier | Thomas RECORDING GmbH | AN000328 | Rechargeable accumulator power supply for the Miniature differential preamplifier (MDPA-2). |
| Accumulator charger (US) | Thomas RECORDING GmbH | AN000167 | Accumulator charger for the power supply AN000328 (US mains power outlet conenctor) |
| Accumulator charger (EU) | Thomas RECORDING GmbH | AN000168 | Accumulator charger for the power supply AN000328 (EU mains power outlet connector) |
| Differential preamplifier/main amplifier/bandpass filter | Thomas RECORDING GmbH | AN000677 | TREC AC Main Amplifier (LabAmp-03) is a single-channel, differential main amplifier for neurophysiological applications (e.g. extracellular recording with microelectrodes). This Instrument is designed to work with the miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2. The single channel of the LabAmp-03 contains a high-gain, low-noise differential amplifier stage followed by low frequency and high-frequency filters. The amplifier has two different filter amplifiers, a single unit activity (SUA) filter –amplifier and a local field potential (LFP) filter amplifier, both are connected parallel in the signal path. Record Mode offers two levels of signal gain (x10, x100) in a first stage and 4 additional levels (x5, x10, x25 and x50) in a final amplifier stage. Each amplifier has different bandpass characteristics for single unit activity (SUA) 500Hz…20kHz and local field potentials (LFP) 0,1Hz…140Hz. An audio monitor and a window discriminator is integrated in the device. The LabAmp-03 has an integrated audio monitor with loudspeaker. This unit provides audio reproduction of electrophysiological signals. The unit combines an audio amplifier in a compact, rugged package. This is especially suited to monitoring neural firing and muscle contractions. The audio monitor input is internally connected to the SUA-Filter amplifier output. The LabAmp-03 is delivered with external power supply for a mains power operation voltage range of 100-240V AC/50-60Hz. |
| USB Oscilloscope | Thomas RECORDING GmbH | AN001096 | USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. This 2-channel PC oscilloscope is perfect suitable for mobile use on a laptop and permanent installation in control cabinets, industrial equipment and many other applications where a small, lightweight and powerful oscilloscope is required. This oscilloscope is connected to the signal output of the main amplifier is for display of recorded extracellular activity during the implanation of the implantable microelectrodes for the Thomas Wireless System (TWS). The user can acquire the measurement data over the several data-interfaces directly on the PC with includes PC software. |
| Stimulus generator | Multichannel Systems | STG3008-FA | Stimulus Generator for Current (STG) and Voltage Driven Stimulation fulfill three functions: current driven stimulation, voltage driven stimulation, controlling and timing. The STG is available with 2, 4 or 8 independet output channels. Featuring integrated isolation units for each output channel, the STG is able to provide any arbitrary waveform. |
| Cap protector for the electrode | Thomas RECORDING GmbH | AN001193 | Protective cap for implantable electrode unit for the Thomas Wireless System |
| Surgical equipment | Scissors, blunt-end forceps, spatulas, surgical clippers, dental drill, and cotton buds | ||
| Drugs and chemicals | Isoflurane, xylocaine, tramadol hydrochloride (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Germany), dexpantenol eye salve (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Germany), 3% hydrogen peroxide, povidone-Iodine (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Germany) and 70% ethanol; | ||
| Fixation material including | Stainless steel screws (BN650 M1.2×5; 4.7 mm ), acrylic resin (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germany), ultraviolet glue (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Germany) and cap protector (Thomas Recording GmbH, Giessen, Germany); | ||
| Additional material | Gloves, heating pad, syringes, and physiological saline. | ||
| Small Animal Stereotaxic Instrument (SASI) | Thomas RECORDING GmbH | AN000287 | The model should be chosen according to the animal (rat, guinea pig, monkeys, etc) used in the study |
| Video camera | EverFocus | EverFocus, model: EQ150 | |
| Open field | Made of transparent or gray acrylic, having round shape measuring 40x40x40cm | ||
| Elevated plus maze | Made of gray acrylic and consisted of two open arms (50 cm long x 10 cm wide) and two closed arms (50 cm long x 10 cm wide, with 40 cm high walls) that extended from a central platform elevated 50 cm above the floor. |
References
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Citer Cet Article
Melo-Thomas, L., Engelhardt, K., Thomas, U., Hoehl, D., Thomas, S., Wöhr, M., Werner, B., Bremmer, F., Schwarting, R. K. A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats. J. Vis. Exp. (129), e56299, doi:10.3791/56299 (2017).