Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

모든 수술 및 동물 취급 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 연구 위원회)의 인디애나 대학 학교의 약 기관 동물 관리 및 사용 지침에 대 한 가이드 아래 승인으로 수행한 위원회입니다. 2 광자 영상 설치의 도식 적인 그림은 그림 1에 표시 됩니다. 1. 영상에 대 한 동물을 준비합니다. 수술 영역 (표 1)에 멸 균 거 즈, 면봉, 고 압력가 수술 도구를 배치 합니다. 수술 도구 intersurgery 살 균을 위한 마이크로 비드 소독 기를 켭니다. 케 타 민 (17.2 mg/mL), xylazine (0.475 mg/mL) 및 acepromazine (0.238 mg/mL) (6 µ L/g 몸 무게)의 혼합물의 복 주사 (i.p.) 마우스 (남성 또는 여성, 1.5-2.5 개월, 20-25 g)을 anesthetize. 동물 발가락 꼬집어 자극에 응답 하 고 없이 각 막 반사 마 취의 적절 한 깊이 도달할 때까지 기다립니다. 수술 동안 주고 부스터 복용량 1/3의 마 취약으로 칵테일의 원래 복용량 원래 마 취 상태를 유지 하는 데 필요한. Buprenorphine를 피하 주사 (사우스 캐롤라이나, 0.05-0.10 mg/kg) 수술 전 진통 대리인으로. 각 막 건조, 백 내장 형성을 방지 하기 위해 동물의 눈을 보호 연 고를 적용 합니다. 저체온증을 방지 하기 위해 커버 메 마른 외과 용 드 레이프와 난방 패드에 GCaMP6s 유전자 변형 마우스를 놓습니다. 생쥐 머리 들고 어댑터와 동물의 머리를 고정 시켜야 합니다. 대부분의 두 번에 지 면도날으로 두 피에 머리를 면도. Povidone-요오드 솔루션 다음 살 균 알코올 준비 패드와 함께 외과 영역을 청소. 2. 만성 두개골 창 준비 두 피 (2 m m x 3 m m)의 직사각형 잘라 한쪽 (오른쪽)의 두개골에가 위를 확인 합니다. 노출 영역을 만들려면 면봉으로 옆으로 피부를 밀어 > 3 m m 직경 (그림 3A). 부드럽게 무딘 microsurgical 블레이드 (메스 블레이드 #10;와 두개골 된다고 하 여 두개골에 연결 하는 결합 조직 제거 그림 3C)입니다. 부드럽게 원을 그려 S1 영역 표시 (3 m m 직경, 센터 조정:는 bregma와는 중간에서 2.5 m m-1.5 m m)는 치과 사용 하 여 두개골에 드릴 (그림 2B). 왼쪽된 두개골 (그림 2B)에 동일한 절차를 수행 합니다. 치과 시멘트 응용 프로그램에 대 한 기초를 제공 하기 위해 뼈에 Cyanoacrylate 슈퍼 접착제의 얇은 층을 적용 됩니다. 해 현미경 원형 홈 고속 microdrill (그림 3D)를 사용 하 여 S1 주변 두개골에 아래로 얇은. 목적은 그것에 광학 창의 배치에 대 한 부드러운 가장자리를 만드는 것입니다. 반복 시추 촉진 하 여 열을 방산 숱이 과정 정기적으로 두개골 인공 척수 (실제, 실 온) 적용 됩니다. 간헐적으로 마찰 유도 과열 방지를 위해 드릴링을 수행 합니다. 집 진공 라인 또는 진공 펌프와 뼈 파편 떨어져 빨 아. 뼈의 약 2/3 깊이 뚫고 후 천천히 그리고 신중 하 게 얇은 나머지 1/3 뼈까지 (뼈 플랩) 두개골의 원형 조각 주변의 두개골에서 완전히 무료입니다. 천천히, 그리고 신중 하 게 # 5/45 집게의 쌍으로 원형 뼈 플랩을 제거 하 고 경질 (그림 2C; 노출 그림 3E)입니다. 노출 된 뇌 영역 실제 (그림 3E)와 촉촉한 유지. 이후 출혈 뇌 혈액 흐름을 변경, 붓기, 뇌를 가속 되며 심각 하 게 이미지 품질이 저하 pial 배에 어떤 손상을 하지 마십시오. 두개골 (contralateral) 왼쪽에 동일한 절차를 수행 합니다. 광 창 조립, 광학 접착제 접착제 및 사이 coverglass 레이어 하나 한 번에 치료를 사용 합니다. 필요한 경우, 따뜻한 접착성 접합을 강화 하는 인큐베이터에 광 창 (50 ° C 12 h에 대 한). 2 부분을 포함 하는 광학 창: 윗부분 5 m m의 직경을 가진 단일 라운드 커버 유리를 포함 하 고 하단 부분 직경 3 mm (그림 2D)와 1-3 라운드 커버 안경 포함. 광 창 에탄올 (70%, vol/vol)에 저장 하 고 사용 하기 전에 멸 균 식 염 수로 그것을 씻어. 광 창 설치 하기 전에 결함, 아래는 stereoscope 광학 접착제 또는 부정확 한 정렬의 잘못 된 금액을 포함 하 여 광학 창을 확인 합니다. 광 창 craniotomy 지역 (그림 2D) 설치. 광학 창 윗부분은 두개골에 달려있다 고 광학 창의 아래쪽 부분 craniotomized 오프닝에서 맞는 CSF (2D 그림, E)의 경질에 달려있다. 광 창 가장자리 (그림 2F; Cyanoacrylate 슈퍼 접착제로 두개골의 윗부분을 밀봉 그림 3 층)입니다. Cyanoacrylate 슈퍼 접착제 건조, 검은 치과 시멘트 (Dentsply) 커버 유리 가장자리에 적용 됩니다. 모든 노출 된 두개골을 치과 시멘트를 적용 하 고 여백을 빛 (그림 2G-H; 차단 상처 그림 3B)입니다. 왼쪽에 동일한 절차를 수행 합니다. 난방 패드에 복구 하 고 적절 한 모니터링에서 복구에 대 한 그것의 가정 케이지를 동물을 반환을 동물 허용. 젖은 음식을 씹는 및 수 화를 제공 합니다. 통증을 줄이기 위해, 관리 buprenorphine 사우스 캐롤라이나 (0.05-2.0 mg/kg) 2 일 동안 매 8-12 h postinjury. 마우스를 복구할 수 있도록 영상 전에 추가 7-10 일. 3. 2-광자 이미징 실험 당일, 동물 마 취 제와 xylazine (복용량 및 위에서 설명한 대로 마 취의 유지 보수) anesthetize. 75% (vol/vol) 에탄올과 두개골 창을 청소. 2 P 현미경와 머리 잡고 어댑터, 귀 바 마우스 머리 소유자에 연결 된 통해 움직일 머리와 생리대에 휴식의 구성 된 영상 설정에서 마우스를 놓습니다. 이미지의 한 번에 광학 창 한쪽. 광학 착오를 최소화 하기 위해 광학 창 및 오른쪽 두개골 현미경의 광 축에 수직으로 지향된은 있는지 확인 합니다. 높은 배율 2 P angiographies (그림 4A1) 등록에 대 한 참조 맵으로 4 배 확대에 밝은 필드 조명 두개골 윈도우의 초기 그림을 가져가 라. 10 배 확대 (그림 4A2)를 사용 하 여 관심 영역을 확대 합니다. S1 영역에 대 한 관심의 영역에서에서 선택 대뇌 피 질의 레이어 I 또는 II (pial 표면 아래 150 µ m)까지 합니다. 높은 확대를 원하는 경우 20 X 목표를 사용 합니다. 여러 개의 신경 세포와 보기의 필드에 대 한 검색. 2 P 현미경 (그림 4B)를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. 노출 시간 및 여기 광 레벨 (≈910 nm)는 깊이에 따라 및 GCaMP6s, 더 긴 노출 시간을 요구 하는 약한 신호 및 concordantly 시간 분해능 덜 식 수준 결정 합니다. 우리는 일반적으로 픽셀 노출 시간 당 ~ 4 µ s를 사용합니다. 512 × 512 픽셀의 해상도에서 3-5 Hz의 프레임 속도로 이미지를 취득 합니다. 시계열을 기록 하기 시작 합니다. 낮은 확대 이미지에 관심 (ROI) 표준 포인트 또는 혈관 패턴 기준으로 모든 영역의 좌표를 저장 합니다. 시간이 지남에 따라 같은 투자 수익을 이미지. S1 영역 왼쪽된 반구에의 칼슘 역학을 관찰 하는 동일한 절차를 수행 합니다. 각 투자 수익에서 형광에 변화를 계산 합니다. 개별적으로 또는 시간 경과 영화 (그림 4C1-C3, D, E)로 이미지를 획득. 이미징 형광 dextran 염료 2 P 현미경으로 설치류의 꼬리 정 맥에 주입 하 여 대뇌 피 질의 혈액 흐름 역학에서 vivo에서 공부 합니다. 랜드마크로 서 vasculatures를 사용 하 여 인식 하 고 이미지를 오랜 기간 동안 세션을 이미징에 동일한 투자 수익. 4입니다. 데이터 처리 ImageJ 및 출처를 사용 하 여 이미지 분석을 위한. ImageJ (그림 5A-B)와 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 개별 이미지 (또는 t-시리즈 영화)에 대 한 군데 신경 및 2 배경 측정 (그림 5C) 지역 근처 별도 ROI를 선택 합니다. 투자 수익 관리자 (그림 5C) 총 강도 취득 합니다.참고: 그림 6 은 대표적인 칼슘 이미지를 보여 줍니다. 칼슘 과도 (녹색)과 혈관 (적색) 표시 다른 시간 지점에서 초 (그림 6A-D) 7 d 마우스에서 초기 윈도우 설치 후. 빨간색과 녹색 채널 (그림 6E) 또는 녹색 채널 (그림 6 층)에 대 일 분 녹화 기간 z 투영 표시 됩니다. Z-프로젝션은 러프와 원 경계 (모든 프레임에 대 한 관심의 개체 신경 포괄) 수동으로 선택 배경 영역 ( 근처 독립 2의 선택 뿐만 아니라 영화에 모든 이미지의 압축 된 이미지를 표시 그림 6G). 각 투자 수익에서 계산 평균 형광 배경, FB FB (FB1 + f b 2) = 2, 형광의 그리고 변화 소마 (F)로 표시 / δ/F, δ/F = (F-FB) / FB. ImageJ 기준선 보정, 피크 찾기/결정, 피크 통합, 피크, 피팅 또는 Time-Saving 피크 분석 기능 등의 기능을 사용 하 여 단계적으로 피크 분석을 수행 합니다.