Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse
Summary
Wir beschreiben ein experimentelles Verfahren zur Messung der neuronalen Aktivität durch dual optische Fenster über bilaterale primären somatosensorischen Corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene Mäuse mit 2-Photonen (2P) Mikroskopie in Vivo.
Abstract
Das Gehirn von Säugetiere weist deutliche Symmetrie in der Sagittalebene. Detaillierte Beschreibung der neuronalen Dynamik in symmetrischen Gehirnregionen bei erwachsenen Säuger bleibt jedoch schwer. In dieser Studie beschreiben wir ein experimentelles Verfahren zur Messung der Kalzium-Dynamik durch dual optische Fenster über bilaterale primären somatosensorischen Corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene Mäuse mit 2-Photonen (2P)-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht Aufnahmen und Quantifizierungen der neuronalen Aktivität in bilateralen Maus Gehirnregionen eins zu einem Zeitpunkt im gleichen Experiment für einen längeren Zeitraum in Vivo. Schwerpunkte dieser Methode, die innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden können, sind minimal-invasive Chirurgie Verfahren zum Erstellen von dual optische Fenster und die Verwendung der 2P-Bildgebung. Obwohl wir nur die Technik im Bereich S1 zeigen, kann die Methode auf andere Regionen des lebenden Gehirns erleichtern die Aufklärung der strukturellen und funktionellen Komplexität des Gehirns neuronale Netze angewendet werden.
Introduction
Kalzium und seine Regulierung sind unerlässlich bei der Vermittlung mehrerer physiologischer Prozesse. Überwachung von Kalzium Dynamik ist hilfreich für das Verständnis der normalen Gehirnfunktion sowie pathologische Zustände des Gehirns Störungen 1,2,3,4,5,6 ,7,8. GCaMP6s Fluoreszenz Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Quantifizierung der Spike-Nummern, timing, und Frequenz sowie Ebenen der synaptischen Eingang sowohl in Vitro und in Vivo 9,10,11.
Das Gehirn von Säugetiere weist deutliche Symmetrie in der Sagittalebene. Obwohl neuere neurologische Forschung über die kortikalen Umgestaltung Aufschluss hat und neuronaler Aktivität durch traumatische Gehirn oder Rückenmark Verletzungen 6,7, die Rollen, dass intakte Gewebe der symmetrisch ausgelöst spielen entsprechende Regionen bei der Wiederherstellung sind noch unklar.
In dieser Studie beschreiben wir experimentelle Verfahren zum Erstellen von bilaterale symmetrische optische Fenster für in-Vivo Bildgebung. Mit dieser optischen Fenster, beschreiben wir das Messen von Kalzium Dynamik von primären somatosensorischen Cortex (S1) in GCaMP6s transgene Mäuse mit 2P Mikroskopie. Im Abschnitt “Ergebnisse” zeigen wir auch in Vivo dendritischen Morphologie zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der S1-Region in den EGFP transgenen Mäusen mit 2P Bildgebung. Die Beobachtungsmethode hinsichtlich der Netzwerk-Dynamik in den bilateralen S1-Bereichen ist aber ein erstes Beispiel von wie dual kranialen Fenster Neurowissenschaftler, lokalen und symmetrische Informationsverarbeitung in das Erwachsene Gehirn von Säugetieren in normalen Sonde hilft Bedingungen oder bei anderen Krankheit in VivoModellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zwei-Photonen-Bildgebung ermöglicht die gleichzeitige Messung der Aktivität von vielen Zellen mit einer vernünftigen Auflösung bei bis zu ca. 800 µm unterhalb der Oberfläche des Gehirns. Wir integrierte 2P und eine dual optische Fenster-Technik mit genetisch codierten GCaMP6s Kalzium Dynamik in den Bevölkerungen der Schicht V neuronalen Somata befindet sich beobachten > 500 µm unterhalb der Pia. Bei offenem optische Fenster auf jeder Seite des Schädels ermöglicht die Methode Aufnahmen der neuronalen Aktivität über symmetrische Gehirn von Säugetieren Regionen für lange und stabile Kalzium in Vivoimaging. Schwerpunkte dieser Methode sind die Leistung der minimal invasiven Chirurgie duale offenen Schädel optische Fenster erstellen und 2P Bildgebung neuronaler Aktivität in symmetrischen S1-Regionen.
Prüfung der Netzwerkaktivität in bilateralen S1 Regionen ist ein Beispiel für wie dual kranialen Fenster verwendet werden könnten, lokalen und symmetrische Informationsverarbeitung im erwachsenen Gehirn in Vivozu untersuchen. Diese Methode kann auch verwendet werden, zur Untersuchung der neuronalen Aktivität (z.B. mit Hilfe von Thy1 –GCaMP6s Mäusen) und kortikale Plastizität B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J von intaktem Gewebe der entsprechenden symmetrischen Regionen Erholung nach Deafferentation aufgrund einer einseitigen CNS Verletzung. Die Methode kann auch verwendet werden, kortikale Aktivität als Reaktion auf periphere Stimulation Strategien wie optogenetische, elektrische oder chemische Reize zu untersuchen. Obwohl wir nur die Technik im Bereich S1 zeigen, könnte dieser Ansatz eingesetzt werden, um die Aktivitäten in anderen symmetrischen Gebieten lebenden Gehirn wie der Schicht V Neuronen des primären motorischen Kortex (M1) untersuchen. Bemerkungen zur Reorganisation von Hirnregionen können ein neuronales Substrat für adaptive motor Verhalten liefern, die eine entscheidende Rolle bei der postinjury Wiederherstellung der Funktion spielt. Es ermöglicht auch chronischen Messung der symmetrischen Aktivität genetisch identifizierten Zellen während Verhalten bei Mäusen Kopf fixiert.
Technisch sollten Ermittler sorgfältig auf die Qualität und Konsistenz der dual kranialen Fenster achten. Ausgedünnt-Totenkopf kranialen Fenster Technik 12 empfiehlt sich für Anfänger zum üben. Stacheln sind Kalzium Fächer aufgrund ihrer Morphologie und lokale Zustrom und Extrudieren Mechanismen. In dieser Studie verwendeten wir B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J Mäusen als Beispiel dendritische Wirbelsäule Dynamik in Vivo (Abbildung 4) nachweisen. Eine offenen Schädel Glas Fenster Installation verursachen hohe Wirbelsäule Umsatz und reaktive glialer Reaktionen nach Chirurgie 12. Im Gegensatz dazu können mit verdünnt-Totenkopf Fenstertechnik, Stacheln und Dendriten gut konserviert werden.
Auswahl an Abmessungen und dicken von optischen Fenster werden das gewünschte Sichtfeld, die Krümmung der Schädel, Schädel Dicke und die Art der Bildgebung 13abhängig sein. Zu niedriger Druck des optischen Coverglasses auf die Dura verursachen Verdickung der Dura, Nachwachsen des Schädels, und Gehirn Bewegung erhöht. Im Gegensatz dazu kann übermäßiger Druck des optischen Coverglasses kortikalen Blutfluss behindern.
Für optische Fenster Montage kleben und zusätzliche Schichten von Coverglasses eine zu einem Zeitpunkt mit optischen Kleber und langwellige UV-Licht zu heilen. Zur Stärkung der Klebtechnik warm gefertigte Fenster (50 ° C für 12 h) in einem Inkubator. Optische Fenster Deckglas in Ethanol 70 % (Vol/Vol) aufbewahren und vor der Operation mit steriler Kochsalzlösung durchspülen. Das optische Fenster für Mängel (z. B. einen falschen Betrag des optischen Klebstoff oder ungenaue Ausrichtung) untersucht werden muss unter einem Stereoskop vor Gebrauch, Fehler zu vermeiden. Wenn der optische Klebstoff zu dünn ist, kann Lufträume zerknittert werden die optischen Aberrationen oder Deckglas Ablösung mit der Einnistung führen kann. Im Gegensatz dazu kann zu viel optischen Kleber Überlauf vorbei an den Rändern des kranialen Fensters zu verursachen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, beschreiben wir hier ein experimentelles Verfahren zur Messung von Kalzium Dynamik oder dendritische Morphologie durch kranialen Fenster aus 2 symmetrischen primäre somatosensorische kortikalen Regionen Thy1-GCaMP6s und Thy1– YFP transgene Mäuse, bzw. Verwendung 2P Mikroskopie. Diese Technik kann erheblich erleichtern sezieren die komplexe strukturelle und funktionelle Beziehung neuronaler Netze.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind sehr dankbar, Wenbiao Gan (Skirball Institute, Institut für Physiologie und Neurologie, New York University School of Medicine, USA) für hervorragende technische Anleitung und Patti Raley, Medical Editor (Abteilung der neurologischen Chirurgie, Indiana Universitätsschule von Medizin), für die Bearbeitung der Handschrift. Wir danken Dr. Jinhui Chen (Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, USA) für die Bereitstellung von B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J Mäusen. Diese Arbeit wurde teilweise durch die Gründung der Direktor des Allgemeinen Krankenhauses von Jinan militärische Region von Chines PLA 2016ZD03 unterstützt (XJL) und NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, Verdienst Review Award I01 BX002356 aus dem US-Department of Veterans Angelegenheiten, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana Rückenmark und Gehirn Verletzungen Research Foundation, Mari Hulman George Stiftungsfonds (XMX).
Materials
| C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
| B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
| Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
| Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
| Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
| Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
| Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
| Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
| Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
| Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. Functional specialization of mouse higher visual cortical areas. Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Katona, G., et al. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Zhang, K., et al. Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice. PLoS One. 10 (7), e0132077 (2015).
- Keck, T., et al. Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo. Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism. Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
- Wachowiak, M., et al. Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb. J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
