Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

Toutes les procédures de traitement chirurgical et animaux ont été effectuées tel qu’approuvé en vertu du Guide pour les soins et Use of Laboratory Animals (National Research Council) et les lignes directrices de l’Indiana University School of Medicine institutionnels Animal Care et l’utilisation Comité. L’illustration schématique de l’installation d’imagerie 2 photons est illustrée à la Figure 1. 1. préparation de l’Animal pour l’imagerie Placez une gaze stérile, cotons-tiges et des instruments chirurgicaux stérilisés à l’autoclave dans le domaine de la chirurgie (tableau 1). Allumez une Micro perle stérilisateur pour intersurgery stérilisation des instruments chirurgicaux. Anesthésier la souris (mâle ou femelle, 1,5 à 2,5 mois, 20 à 25 g) par injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (17,2 mg/mL), de xylazine (0,475 mg/mL) et d’acépromazine (0,238 mg/mL) (6 µL/g de poids corporel). Attendez que la profondeur de l’anesthésie est atteint lorsque l’animal cesse de répondre à un stimulus de pincée d’orteil et n’a aucun réflexe cornéen. Au cours de la chirurgie, donner une dose de rappel du 1/3 la dose initiale de l’anesthésique cocktail comme nécessaire pour maintenir l’état anesthésique original. Injecter la buprénorphine par voie sous-cutanée (s.c. ; 0,05 à 0,10 mg/kg) comme agent analgésique avant la chirurgie. Pommade protectrice aux yeux de l’animal pour empêcher la formation de séchage et de cataracte cornée. Placez une souris transgénique GCaMP6s sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie et le recouvrir d’un drap stérile chirurgical. Stabiliser la tête de l’animal avec un adaptateur de Holding de tête de souris. Se raser la tête dans la majeure partie du cuir chevelu avec un grattoir à lame double. Nettoyer la zone chirurgicale avec un tampon de préparation d’alcool stérile suivi de solution de povidone-iode. 2. chronique fenêtre crânienne préparation Faites une coupe rectangulaire du cuir chevelu (2 x 3 mm) avec une paire de ciseaux sur un côté (à droite) du crâne. Pousser la peau côté avec un coton-tige pour créer un espace d’exposition de > 3 mm de diamètre (Figure 3 a). Retirez le tissu conjonctif attaché au crâne en grattant doucement le crâne avec une lame émoussée microchirurgicale (lame de bistouri Swann-Morton n ° 10 ; La figure 3). Délimiter la zone de S1 en appuyant doucement sur un cercle (3 mm de diamètre, centre de coordination :-1,50 mm le bregma et 2,5 mm de la ligne médiane) sur le crâne à l’aide d’un dentaire percer (Figure 2 b). Effectuez la même procédure sur le crâne de gauche (Figure 2 b). Appliquer une fine couche de colle Super cyano à l’OS pour fournir une base pour l’application de ciment dentaire. Sous un microscope à dissection, diluer une rainure circulaire dans le crâne autour de la zone de S1 à l’aide d’un microforages à grande vitesse (Figure 3D). Le but est de créer un bord lisse pour le placement d’une fenêtre optique dessus. S’applique à plusieurs reprises artificiel liquide céphalo-rachidien (ACSF, température ambiante) au crâne périodiquement pendant le processus d’amincissement pour permettre de semer et de dissiper la chaleur. Effectuer le forage par intermittence pour éviter toute friction induite par la surchauffe. Sucez loin les débris osseux avec une ligne vide de la maison ou une pompe à vide. Après avoir une profondeur d’environ 2/3 de l’OS est percée, lentement et soigneusement mince l’OS 1/3 restant jusqu’à ce qu’une pièce circulaire du crâne (lambeau osseux) est offert gratuitement sur le crâne environnant. Lentement et soigneusement retirer le lambeau osseux circulaire avec une paire de pinces # 5/45 et exposer la dure-mère (Figure 2; Figure 3E). La région du cerveau exposé garder humide avec ACSF (Figure 3E). Éviter d’endommager les vaisseaux pial, puisque l’hémorragie sera modifie le flux sanguin cérébral, accélérer le gonflement de cerveau et gravement dégrader la qualité de l’imagerie. Effectuez la même procédure sur le côté gauche (controlatéral) du crâne. Pour assembler la fenêtre optique, utiliser l’adhésif optique à colle et cure entre couches de lamelle un à la fois. Si nécessaire, réchauffez la fenêtre optique (50 ° C pendant 12 h) dans un incubateur pour renforcer le collage. La fenêtre optique comprend 2 parties : la partie supérieure contient un seul verre couvercle rond d’un diamètre de 5 mm et la partie inférieure contient 1 – 3 verres de couverture rondes avec un diamètre de 3 mm (Figure 2D). Stocker la fenêtre optique dans l’éthanol (70 % vol/vol) et le rincer avec du sérum physiologique stérile avant utilisation. Avant l’installation de fenêtre optique, vérifiez la fenêtre optique par rapport aux défauts, y compris un montant erroné d’alignement optique d’adhésif ou inexact dans un stéréoscope. Installer la fenêtre optique au-dessus de la région de craniotomie (Figure 2D). La partie supérieure de la fenêtre optique repose sur le crâne et la partie inférieure de la fenêtre optique s’inscrit dans l’ouverture de craniotomized et repose sur la dure-mère en présence de CSF (Figure 2D, E). Sceller la partie supérieure de la bordure de fenêtre optique pour le crâne avec le Cyanoacrylate Super Glue (Figure 2F; Figure 3F). Lorsque le Cyanoacrylate Super colle est sèche, appliquer le ciment dentaire noir (Dentsply) pour couvrir le bord du verre. Appliquer le ciment dentaire sur tout le crâne exposé et blesser les marges pour bloquer la lumière (Figure 2-H; Figure 3 b). Effectuez la même procédure sur le côté gauche. Permettre à l’animal de récupérer sur le coussin chauffant et regagner sa cage maison pour récupération sous une surveillance appropriée de l’animal. Fournir de la nourriture humide pour faciliter la mastication et l’hydratation. Pour réduire la douleur, administrer la buprénorphine l.c. (0,05 – 2,0 mg/kg) chaque postinjury de 8 à 12 h pendant 2 jours. Permettre à la souris pour récupérer les 7 à 10 jours avant l’imagerie. 3. deux photons d’imagerie Le jour de l’expérience, anesthésier l’animal avec la kétamine et de xylazine (doses et l’entretien de l’anesthésie, comme décrit ci-dessus). Nettoyer la fenêtre crânienne avec éthanol 75 % (vol/vol). Placez votre souris sous un système d’imagerie consistant en un microscope 2p et l’adaptateur de tenir tête, reposant sur un coussin chauffant avec sa tête immobilisée par le biais de barres d’oreilles attachés à un support de tête de souris. Un côté de la fenêtre optique d’image à la fois. Pour minimiser les aberrations optiques, assurez-vous que la fenêtre optique et le crâne de droite sont orientés perpendiculairement à l’axe optique du microscope. Prendre une photo initiale de la fenêtre crânienne avec illumination du champ lumineux à un grossissement de x 4 comme une carte de référence d’enregistrement avec coronarographie de 2p grossissement plus élevé (Figure 4 a1). Zoomez sur la zone d’intérêt en utilisant un grossissement de x 10 (Figure 4 a2). Sélectionnez un domaine d’intérêt dans la zone S1 en couches corticales I ou II (jusqu’à 150 µm au-dessous de la surface pial). Si un grossissement supérieur est souhaité, utilisez un objectif 20 X. Vous recherchez un champ de vision avec plusieurs neurones. Acquisition d’images à l’aide d’un microscope de P 2 (Figure 4 b). Déterminer la durée d’exposition et le niveau d’excitation lumineuse (≈910 nm) basé sur la profondeur et le niveau d’expression de GCaMP6s, avec des signaux plus faibles nécessitant des temps d’exposition et aujourd’hui moins de résolution temporelle. Nous utilisons généralement ~ 4 µs par temps d’exposition de pixel. Acquérir des images à une vitesse de 3 à 5 Hz avec une résolution de 512 × 512 pixels. Commencer à enregistrer les séries temporelles. Stocker les coordonnées de toutes les régions d’intérêt (ROI) par rapport au modèle vasculaire ou aux points de repères dans des images de faible grossissement. Image du ROI même au fil du temps. Effectuez la même procédure pour observer la dynamique du calcium de la zone de S1 sur l’hémisphère gauche. Calculer les changements de fluorescence de chaque ROI. Acquérir des images à titre individuel ou comme un film time-lapse (Figure 4,1-C3, D, E). Étudier sanguin cortical flux dynamique in vivo par imagerie colorants fluorescents dextran injectés dans la veine caudale des rongeurs avec la microscopie 2p. Utiliser vasculatures comme repères pour reconnaître et le retour sur investissement même dans l’imagerie des séances durant de longues périodes d’image. 4. traitement des données Utilisez ImageJ et origine pour l’analyse de l’image. Importez des séquences d’images avec ImageJ (Figure 5 a-B). Pour les images individuelles (ou des films de la série t), sélectionnez un retour sur investissement dans un neurone imagé et 2 distincts à proximité de régions pour la mesure de fond (Figure 5). Acquérir une intensité totale avec un gestionnaire de ROI (Figure 5C).Remarque : La Figure 6 montre des images représentatives de calcium. Transitoires de calcium (vert) et des vaisseaux sanguins (rouge) montrent à des moments différents en secondes (Figure 6 a-D) chez une souris au 7D après l’installation initiale de la fenêtre. La z-projection d’une période d’enregistrement de 3 min pour les canaux rouge et verts (Figure 6E) ou le canal vert (Figure 6F) est également montrée. Une projection z affiche une image compressée de toutes les images dans le film, d’où une limite rugueux et cercle (englobant le neurone objet d’intérêt dans tous les cadres) est sélectionnée manuellement ainsi que la sélection des 2 indépendantes dans les régions de fond ( voisines Figure 6). De chaque ROI, calculer le fond moyenne de fluorescence FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 et les changements de fluorescence du soma (F) exprimée en ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB. Effectuer l’analyse de pointe, étape par étape en utilisant les fonctions d’ImageJ, y compris la Correction de la ligne de base, Peak conclusion/détermination, intégration Peak, Peak Fitting ou Time-Saving fonctions d’analyse de pointe.