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Biochimie

Imagerie des tissus amyloïdes colorées avec Luminescent thiol conjugués par Hyperspectral confocale microscopie et imagerie de Fluorescence Lifetime

Published: October 20, 2017
doi:
10.3791/56279
, , ,
1IFM-Department of Chemistry,Linköping University

Summary

Le dépôt amyloïde est une caractéristique des différentes maladies et afflige beaucoup de différents organes. Cet article décrit l’application de la fluorescence luminescents oligothiophènes conjugués coloration en combinaison avec les techniques de microscopie de fluorescence. Cette méthode de coloration représente un outil puissant pour la détection et à l’exploration des agrégats de protéine dans les configurations cliniques et scientifiques.

Abstract

Les protéines qui se déposent comme amyloïde dans les tissus de l’organisme peuvent être la cause ou la conséquence d’un grand nombre de maladies. Parmi celles-ci nous trouvons des maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer et de Parkinson, qui touchent principalement le système nerveux central et l’amylose systémique où amyloïde sérique A, transthyrétine et IgG chaînes légères déposent comme amyloïde dans le foie, le canal carpien tunnel, rate, rein, cœur et autres tissus périphériques. Amyloïde est connu et étudié pendant plus d’un siècle, souvent en utilisant des colorants spécifiques amyloïdes comme le rouge Congo, thioflavine T (ThT) ou thioflavine (ThS). Dans cet article, nous présentons PA63-formyl thiophène acétique (hFTAA) comme un exemple de compléments récemment mis au point pour ces colorants appelés luminescents conjugués thiol (LCOs). hFTAA est facile à utiliser et est compatible avec la collaboration de coloration en immunofluorescence ou avec d’autres marqueurs cellulaires. Des recherches approfondies a prouvé que hFTAA détecte un éventail plus large d’agrégats de protéines maladie liée que colorants amyloïdes conventionnels. En outre, hFTAA peut également être appliquée optique cession des morphotypes agrégées distinctes pour permettre des études du polymorphisme de fibrilles amyloïdes. Alors que la méthode d’imagerie appliquée est facultative, nous avons ici démontrer l’imagerie hyperspectrale (HIS), microscopie confocale à balayage laser durée de vie de fluorescence imaging (FLIM). Ces exemples montrent quelques-unes des techniques d’imagerie où LCOs peuvent être utilisés comme outils pour acquérir une connaissance plus détaillée de la formation et les propriétés structurales des amyloïdes. Une limitation importante de la technique est, en ce qui concerne toutes les techniques de microscopie optique conventionnelle, l’exigence de taille microscopique de granulats pour permettre la détection. En outre, l’ensemble devrait comprendre une structure répétitive du feuillet β permettant la liaison hFTAA. Une exposition excessive fixation et/ou épitope qui modifient la structure de l’agrégation ou la conformation peut rendre hFTAA mauvaise liaison et posent donc des restrictions d’imagerie précis.

Introduction

Les dépôts d’amyloïde dans les tissus sont une caractéristique pathologique dans un numéro des maladies comme la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, l’amylose systémique et maladies à prions. Malgré la prévalence des maladies amyloïdes et le fait que près de 40 différentes protéines à ce jour ont été classés comme des précurseurs amyloïdes dans humain1, on connaît la relation entre les dépôts amyloides et le phénotype de la maladie. Histologie des échantillons provenant de patients humains a été utilisé à la fois à des fins diagnostiques et scientifiques. Un grand nombre de modèles animaux ont été créé pour étudier la corrélation entre la charge amyloïde et comportement, durée de vie et un certain nombre d’autre lecture phénotypique les aboutissants de la progression de la maladie2,3. Grands efforts sont également déployés dans la découverte et la conception pour combattre certaines de nos maladies les plus redoutées généralisées. Toutefois, l’évaluation du lien entre génotype, phénotype, charge de plaques amyloïdes et l’administration de médicaments n’est pas simple. Les outils de coloration et d’imagerie de la substance amyloïde dans les tissus sont souvent émoussés et fournissent des informations de basse résolution sur la structure et la formation d’amyloides.

Rouge Congo biréfringence, ThT et ThS fluorescence sont des exemples de méthodes classiques pour la détection et l’analyse de la charge amyloïde dans des échantillons de tissus de biopsies de patients et des échantillons post mortem et des modèles animaux de maladies4. Ces techniques ont été utilisées pendant plusieurs décennies (rouge Congo depuis les années 1920 et ThT et dérivés depuis les années 1960), et même si l’instrumentation a été affinée et permet une analyse détaillée, les procédures de coloration et les analyses sont toujours accomplies de la même manière qu’il y a près d’un siècle.

Dans cet article, nous décrivons l’utilisation d’un colorant amyloïde roman hautement sensible, hFTAA5, qui permet la détection des dépôts de petites protéines immatures avec une grande précision, ainsi que la détection de la substance amyloïde mature. Par rapport aux colorants classiques, hFTAA a été prouvée pour détecter un large éventail de maladies associés protéines agrégats5,6,7. En outre, hFTAA peut également être appliquée optique attribution des morphotypes agrégées distinctes8. Ici, nous décrivons la coloration hFTAA et l’analyse des tissus d’établie modèles animaux de maladies à prions et protéine de précurseur β-amyloïde (APP) souris transgéniques conçus pour imiter le développement de la plaque dans la maladie d’Alzheimer9,10 . Nous montrons également analyse de diagnostic et des échantillons post mortem de patients atteints d’amylose systémique. Les LCOs ont des propriétés intrinsèques qui leur permet de rendre compte des différences conformationnelles dans une plaque ; et en combinant deux LCOs avec des propriétés différentes au sujet de la liaison et la fluorescence, la différence est encore plus prononcée11. Un microscope à épifluorescence équipé de filtres passe longue et une tête de caméra hyperspectrale est utilisée pour permettre une classification objective des propriétés spectrales et enregistrement de photographies au microscope pour l’analyse spectrale. La microscopie confocal fluorescence avec un laser accordable comme la source d’excitation est utilisée pour évaluer les propriétés en trois dimensions d’une plaque amyloïde plus en détail. Le laser accordable permet de collection du spectre d’excitation et une étape moins sélection de longueur d’onde d’émission sur le microscope permet de co imagerie de fluorescence de CDO et d’immunofluorescence pour déterminer la co-localisation de la protéine cible et amyloïdes. FLIM offre sans précédent de sensibilité aux différences conformationnelles imposées sur les cle et révèle des différences qui ne pourront pas être détectées sur les spectres d’émission de fluorescence.

Les objectifs principaux avec la méthode de coloration décrite sont de faciliter la détection sensible des petits dépôts amyloïdes et de caractériser conformationnelle polymorphisme au sein des dépôts amyloïdes. Cette connaissance est importante pour la compréhension de base des maladies de l’agrégation de protéines.

Protocol

Remarque : synthèse de CDO a été effectuée dans nos laboratoires depuis plus de dix ans. En appliquant essentiellement des protocoles pour la substitution aromatique électrophile, couplage croisé catalysé de palladium, couplage de l’amide et l’hydrolyse de l’ester, Nous personnalisons synthétiquement sondes pour différents buts 5 , 12. après synthèse, caractérisation et de purification, le produit de la CDO est lyophilisé et stocké à température ambiante. Certains des sondes (dont hFTAA) sont maintenant disponibles dans le commerce (voir Table des matières). 1. Solution de coloration LCO Remarque : si hFTAA est acheté auprès d’un fournisseur commercial, veuillez suivre le vendeur ' instructions s au lieu de la section 1. HFTAA remettre le lyophilisé en 2 mM NaOH pour préparer une solution de 1 mg/mL. Garder le stock dans un flacon en verre à 4 ° C. Le stock peut être conservé pendant un an. Le jour de la coloration, préparer une solution par dilution au 1/10 000 actions dans une solution saline tamponnée au Phosphate (PBS). 2. Préparation d’échantillons de tissus Remarque : plusieurs types de tissus peuvent être photographiées en utilisant hFTAA comme un marqueur de l’amyloïde. Pour obtenir des exemples, voir la Figure 1. hFTAA est sensible à la conformation globale. La coloration d’où préférence est souhaitable sur les agrégats ininterrompus et sans exposition épitope. Qualité spectrale optimale est obtenue si la fixation du tissu est réduite au minimum. Donc matériel congelé frais, délicatement fixée dans l’éthanol au moment de la coloration, est préférable. Toutefois, il est possible de détecter des dépôts amyloïdes également dans le tissu qui a été corrigé avec par exemple, formol. hFTAA généralement pénètre le tissu bien. Sélectionnez une épaisseur de l’échantillon qui est compatible avec la destination technique d’imagerie. Si formol fixe, parafinembedded sections sont utilisées, deparafinize dans le xylène pendant la nuit. Tremper les sections dans les bains consécutifs de 99 % d’éthanol, éthanol à 70 %, dH 2 O et PBS, 10 min chacune. Permettre les coupes de tissus à sécher dans des conditions ambiantes. ATTENTION : Xylène est toujours gérée sous une hotte chimique. Xylène et autres solvants organiques sont nocifs. Cryosections décongélation à température ambiante. Difficulté des sections de tissu dans du formol 10 % du jour au lendemain et réhydrater en leur plongeant dans des bains consécutifs de 99 % d’éthanol, éthanol à 70 %, dH 2 O et PBS, 10 min chacune. Permettre les coupes de tissus à sécher dans des conditions ambiantes. Verser des gouttes de la solution de travail hFTAA (environ 200 µL) pour les coupes de tissus pour le couvrir. La goutte devrait rester en place par la tension superficielle. Incuber 30 min à température ambiante pendant la coloration. Rincer la solution colorante avec 500 µL PBS à l’aide d’une pipette et ensuite plonger la lame dans le bain de PBS pendant 10 min. autoriser la section sécher dans des conditions ambiantes. Monter en utilisant le milieu de montage de fluorescence. Permettre aux milieu de montage régler du jour au lendemain. Remarque : hFTAA coloration peut être effectuée en combinaison avec d’autres méthodes de coloration comme immunofluorescence, cellules ou organites des marqueurs spécifiques, etc.. Pour effectuer conjointement une coloration, lancez votre protocole de coloration complète de choix et ajouter hFTAA à la fin, à partir de l’étape 2.2. Pour obtenir des exemples, voir la Figure 2. Pour l’immunofluorescence, préférence sélectionner un anticorps secondaire qui est excité à 640 nm ou supérieur. Dans cette gamme de longueur d’onde, hFTAA n’absorbe pas et donc ne peut pas être heureux et ne sera pas sont fluorescents. Cela garantit qu’aucun cordeau n’est vu entre hFTAA et anticorps. 3. La microscopie Remarque : utiliser un microscope à fluorescence équipé de filtres de longue passe. Tous les paramètres ci-dessous ont été utilisés pour générer les images à la Figure 4. Les adaptations peuvent s’effectue selon l’échantillon de type et de tissu amyloïde. Bien que hFTAA lié à l’amyloïde est stable vers blanchiment, il est conseillé de désactiver la source de lumière lorsque l’échantillon n’est pas examiné ou imagé. HIS Remarque : l’expérience a été réalisée à l’aide d’un microscope à épifluorescence avec filtres de longue passe d’émission et une tête de caméra pour son (voir Table des matières). Utiliser un microscope à fluorescence standard équipé de filtres passe longue et une caméra hyperspectrale. Assurez-vous que la caméra spectrale est calibrée. Dans le logiciel, nommez le projet, sélectionnez " image spectrale " et commencez à acquisition. Sélectionner l’objet de l’intérêt à travers l’oculaire en utilisant le filtre d’excitation de 436 nm et décaler le trajet de la lumière à la caméra. Dans le cas Data Manager (MDP), sélectionnez le type d’échantillon spectrales, étiquette de l’échantillon, et d’acquérir de la presse. La fenêtre d’acquisition ouvrira. Dans la fenêtre d’acquisition " imagerie spectrale ", ouvrez le menu paramètres, sélectionnez Propriétés de l’acquisition et définir le domaine spectral à 460-700, la qualité de vitesse à la vitesse maximale et la mesure type à filtres à gaz/laser/étroit. Fermez la boîte de dialogue. Dans le menu image, sélectionnez vivre pleinement. Dans la barre d’icônes, désactiver franges. Sélectionnez ou la taille d’une région à l’image qui a la valeur de mémoire maximale au-dessous de 800 Mo. Définir la durée d’exposition à une valeur qui donne une luminosité de l’image totale entre 1 000 et 3 000. Dans la barre d’icônes, appuyez sur l’appareil photo couleur. Acquisition va commencer. Lors de l’acquisition d’image est terminée, appuyez sur Save dans le " acquérir image spectrale " boîte de dialogue et " nouvelle cellule " dans la boîte de dialogue Gestionnaire des données de cas. De la CDM, ouvrez l’image recueillie en utilisant le bouton de démarrer l’analyse. La fenêtre d’analyse de données s’ouvre. Spectrales renseignements peuvent être recueillis de chaque pixel de l’image en sélectionnant les ROIs à l’aide de la boîte de dialogue Affichage Spectral. Choisissez " définir " et sélectionnez les ROIs dans les domaines pertinents de l’image. Enregistrer les données spectrales dans un fichier texte à l’aide de la touche de Lib. Le fichier .txt enregistré peut être importé à n’importe quel logiciel d’analyse de choix. Le fichier .slb peut être utilisé pour l’analyse dans le logiciel d’analyse de données. Les données hyperspectrales du cube de l’image entière peuvent également être exportées dans un fichier raw, comme " couches comme tif ", ou comme " couches au format texte " pour les applications d’analyse données et d’images à l’aide d’un logiciel externe. Microscopie confocale Remarque : microscope confocal est équipé d’un laser accordable comme la source d’excitation. Pour toutes les expériences d’émission de fluorescence, ajustez l’intensité du laser à 0,2 % (correspondant à une puissance moyenne de 3 µW), le trou d’épingle à 1 unité aérée, la taille de l’image à 1 024 px x 1,024 px, la vitesse de balayage que 7 et une moyenne de plus de 16 scans et la profondeur de bit 8 bit (voir < s Trong > Table des matières). Ces paramètres doivent être modifiés pour chaque système confocal individuel et source laser type d’échantillon. Pour le spectre d’émission, recueillir les données en utilisant le mode de lambda et l’excitation à l’aide d’argon laser ensemble à 488 nm. Recueillir des émissions entre 503 et 687 nm à l’aide de 22 canaux dans le détecteur GASP 32 canaux. Réglez le gain à 755. Pour obtenir des images monocanal, utiliser la puce mises en place l’option. FITC (filtre vert), réglez le gain à 750 et Alexa 535 (filtre rouge) Réglez le gain à 845. De percevoir le spectre d’excitation avec le laser accordable, utilisez excitation avec 1 nm opérations entre 490 et 545 nm alors qu’elles ramassaient des émissions entre 551 et 586 nm. La valeur de l’intensité du laser à 2 % (correspondant à une puissance moyenne de 30 µW) et le gain à 774. Pour recueillir les Z-pile en mode spectral, de parcourir la profondeur de la section en étapes de 0,96 µm. Les mêmes paramètres d’excitation et d’émission comme dans l’étape 3.2.1 peuvent être utilisés mais Réglez le gain à 730. FLIM Remarque : microscope confocal est équipé d’une unité FLIM (voir Table des matières). Mis en place les paramètres suivants pour la microscopie confocale : sténopé, 20 ; excitation d’onde, 490 nm, l’intensité du laser, 0,5 % (correspondant à une puissance moyenne de 7,5 µW). Utiliser les lasers pulsés à 40 MHz. Logiciel dans le FLIM, mis en place le photon comptant plus de 550 nm. Dans la fenêtre Paramètres d’affichage, suivez le photon comptant jusqu’à ce que le comte Max soit environ 4 000 chefs de photon. Enregistrez le fichier et l’exporter comme image SPC. Tenir les données à une décroissance exponentielle de 2 composants dans le logiciel FLIM. Un ajustement qui donne un χ 2 < 2 est bon. La valeur sur l’axe des ordonnées est le nombre d’échelons pendant la durée de vie donnée. Sélectionner un seuil pour les chefs d’accusation inclure, par exemple, 100. Couleur code par T1 et choisissez la plage de durée de vie. La décroissance est dépendante de la structure amyloïde où le hFTAA est lié. Durées de vie de fluorescence entre 300 et 1 000 ps ont été observées. Enregistrez le fichier. Exporter les données brutes en utilisant les options d’exportation et d’enregistrer les données souhaitées dans un nouveau dossier.

Representative Results

La coloration sensible et sélectif des dépôts amyloïdes d’un grand nombre de protéines dans de nombreux types de tissus différents à la fois des patients humains et les animaux de laboratoire est vitale pour le diagnostic clinique ainsi que dans la recherche scientifique. Dans cet article, nous démontrons comment cela peut être accompli à l’aide de LCOs, illustrées par hFTAA, pour la coloration et l’imagerie multimodale d’amyloïde parmi une sélection de types de tissus. Depuis la première publication de ligands amyloïdes axée sur le thiophène il y a plus de dix ans13, amyloïde dépôts composés d’une large gamme de protéines dans une variété de tissus ont été photographiés à l’aide de LCOs6,7,11, 14,15,16 (figure 1). En combinaison avec des anticorps ou d’autres marqueurs histologiques, les cle offrent des excellents outils à des fins diagnostiques et scientifiques (Figure 1 a, Figure 2). Avec une sélection appropriée des marqueurs fluorescents, plusieurs fluorophores peut être photographiées sur la même section (Figure 1 a, hFTAA et DAPI, Figure 2 a hFTAA dans Configuration de l’immunofluorescence). Il est également possible d’utiliser les sections consécutives pour une coloration à l’aide de fond clair et fluorescence (Figure 2 b, hFTAA et DAB souillure d’anticorps). Récemment, hFTAA s’est avéré pour être un complément très prometteur au rouge Congo de coloration au diagnostic clinique7,15 (Figure 3). Développement de techniques d’imagerie au cours des dernières décennies a augmenté le besoin de teintures amyloïdes qui peuvent distinguer entre la minute, mais les différences profondes même de temps en dépôts amyloïdes de manière quantitative. Le système conjugué au sein de la CDO lui fournit une capacité unique à faire rapport sur la variation de son mode de liaison. Torsion de la molécule peut conduire à des distorsions dans les angles de liaison dans le système conjugué et entraver le transport des électrons (Figure 4 a). Cela correspond à son tour sur les propriétés fluorescentes de la CDO en longueur d’onde d’excitation et d’émission et en durée de vie d’émission. Nous utilisons ses dans un microscope à fluorescence verticale équipé de filtres de longue passe pour l’émission. Pour l’excitation et les spectres d’émission en microscopie confocale et FLIM, nous utilisons un LSM780 avec laser pulsé. Pour illustrer les différentes techniques, nous avons photographié un objet (la plaque amyloïde (Aß) bêta chez une souris transgénique APP) (Figure 4 b–e). Hyperspectral spectres de fluorescence (Figure 4 b) permet l’évaluation des décalages spectres et variation de l’intensité dans les différentes régions de la plaque. Spectre d’excitation en microscopie confocale (Figure 4C) peut être utilisé pour déterminer la longueur d’onde d’excitation optimal pour des expériences en aval, par exemple, combinaison de coloration avec plusieurs fluorophores. Cette méthode peut également s’avérer utile pour la détection des différences conformationnelles dans le mode de fixation du LCO. Spectre d’émission en mode confocal peut être utilisé pour déterminer les propriétés d’émission de fluorescence de hFTAA ou d’une combinaison de plusieurs fluorophores pour évaluer la colocalisation dans des expériences de combinaison avec plusieurs LCOs ou CDO et d’immunofluorescence combinaisons. La durée de vie de fluorescence de hFTAA est fortement influencée par de petites variations dans le mode de liaison du hFTAA. FLIM est donc un outil puissant pour distinguer les différences imposées aux hFTAA par la cible de liaison (Figure 4D). Ceci peut être utilisé par exemple dans la discrimination entre les prions différentes souches8. Imagerie confocale et de transformation Z-piles en images en trois dimensions sont un outil utile pour explorer la forme globale d’un agrégat amyloïde (Figure 4e). Encore une fois, l’utilisation de fluorophores supplémentaires peut aider à comprendre la composition d’un dépôt. Figure 1: divers agrégats de protéines et les types de tissu présentant une coloration h-ZLEA de : (a) Mallory-Denk organes composé d’agrégats de kératine dans le foie (Eosine au DAPI), (b) inclusions r p62 positifs sporadiques corps d’inclusion myosite (s-IBM) tissu musculaire, (c) amyloide du polypeptide amyloïde îlot dans le pancréas humain, cerveau (d), chaînes légères amyloïde d’immunoglobuline dans l’intestin humain, (e), à la brebis tremblante (prions) chez les souris, (f ) Chronique encéphalopathie des cervidés (prions) dans le cerveau de souris, plaques (g), bêta-amyloïdes dans le cerveau de souris APP23, pathologie (h), bêta-amyloïdes dans le cerveau de souris APP/PS1 et biopsie (j’ai) graisse frottis d’échantillons diagnostiques de transthyrétine amyloïde chez des patients humains classés de 1 à 4 selon la notation standard rouge Congo (CR). Zones jaunes montrent hFTAA teinté de dépôts amyloïdes et bleu est autofluorescence du tissu adipeux. La longueur de barre d’échelle est spécifiée dans chaque panneau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : exemples de co marquage avec des anticorps. (un) co marquage avec sérum protéine amyloïde A (AA) immunofluorescence et hFTAA d’humain amyloïde AA sur la même section. En haut à gauche : AA anticorps émission 640 nm ; supérieur droit hFTAA à 488 nm ; panneau inférieur de superposition colocalisation affichage image en jaune. (b), anticorps coloration et hFTAA fluorescence sur des coupes consécutives. Panneau supérieur : AA anticorps DAB coloration, panneau inférieur : hFTAA photographié avec un filtre d’émission de longpass. Echelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : En comparant la fluorescence avec des filtres de courte passe sur transthyrétine amyloïde dans le coeur humain coloré avec hématoxyline/Congo de Mayer rouge (un–d) et hématoxyline/hFTAA de Mayer (e). (un) fond clair image, (b), fond clair, fluorescence, (c) fond clair + polariseurs croisés, (d) fond clair + fluorescence + polariseurs croisés, fluorescence hFTAA (e) en 405nm + une excitation 480 nm (sections consécutives à une–d). Echelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : le même objet souillé avec hFTAA et imagés avec plusieurs techniques est démontré en utilisant une plaque de bêta-amyloïdes chez une souris de APP23 ans. (a) la fluorescence propriétés hFTAA est dicté par son état conformationnel. On montre la structure de hFTAA en état planaire et tordu. (b) Hyperspectral imaging pour évaluation du spectre d’émission continu. Les spectres dans le panneau inférieur sont couleur codée selon boxed régions d’intérêt dans l’image. (c) (i) Confocal imagerie Imagerie d’excitation et de bandes de fréquences (ii et iii) et l’imagerie d’émission en mode filtre ou (iv) spectrale. imagerie de durée de vie (d), Fluorescence pour la détection des différences conformationnels de l’amyloïde, où les durées de vie plus courtes sont trouvent dans la périphérie de la plaque d’Aβ et les temps de vie sont plus longs dans le centre de la plaque. Histogramme dans le panneau inférieur montre la répartition des durées de vie de la plaque entière. L’image est coloré selon l’échelle sous l’histogramme. (e) Z-pile Confocal recueillies en mode filtre pour afficher la structure tridimensionnelle des objets. La longueur de barre d’échelle est spécifiée dans chaque panneau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dépôt de protéines repliées aberrantly dans amyloïde est un événement clé de nombreux processus morbides. Les plaques amyloïdes extracellulaires composée de peptides bêta-amyloïdes et des enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires formées par tau hyperphosphorylée sont trouvent dans le cerveau des patients de la maladie d’Alzheimer. Une gamme de différentes protéines, par exemple, transthyrétine (TTR), composant de sérum amyloïde A (SAA) et repliement de la chaîne légère de IgG et manifeste comme des dépôts amyloïdes dans les tissus à l’extérieur de la CNS. Bien qu’amyloïde dépôts ont été connus et étudiés pendant plus d’un siècle, nous avons toujours n’ont pas une connaissance détaillée de comment amyloïde dépôts sont initiée au niveau moléculaire et que peut-on faire pour empêcher ce processus. Pour la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire corroborer comment le processus de l’amylose est associé de la neurodégénérescence. Une quête clée sur la mission pour traiter l’amylose est de développer le roman affinés outils de surveillance amyloïde initiation, progression et régression ; donc ciblée détection amyloïde est la clé. Diagnostic clinique profiteront à long terme, augmente la sensibilité et la sélectivité de l’amyloïde coloration méthodes7,15. Défis actuels dans ce domaine sont énormes et sont un domaine de recherche très actif. Une question principale de développement clinique et d’essais est diagnostic pronostique. Ces maladies susceptibles de commencent bien avant l’apparition des symptômes, mais de commencer par traitement il doit être l’identification de la maladie. Dans les présentes, la sensibilité est un aspect clé des nouvelles méthodes. En outre, ce problème est encore plus complex parce que certains agrégats de protéines sont toxiques, certaines sont protecteurs, et certains sont neutres. D’où la possibilité de surveiller les morphotypes agrégées spécifiques est essentielle puisque l’existence d’espèces agrégées distinctes a été suggérée pour expliquer le phénotype hétérogène pour une diversité des maladies de l’agrégation de protéines neurodégénératives. Par exemple, la protéine prion est un exemple classique de comment une identique séquence primaire des acides aminés peut défectueuse en morphotypes agrégat distinct, qui donnent naissance à des souches de prions spécifiques. Polymorphisme semblable a aussi signalé pour le peptide Aβ, α-synucléine et tau. À cet égard, LCOs ont démontré de remarquables outils optique affectation des morphotypes agrégées distinctes. Agrégats tau ont été distingués en raison du phénomène optique conformationnellement induit observé depuis les cle et agrégats de protéine prion spécifiques à la souche, dépôts de protéines trouvées dans plusieurs types d’amylose systémique, ainsi que Aβ polymorphe.

Le dépôt amyloïde est un événement qui se déroule dans les tissus qui sont difficiles à pénétrer avec des méthodes biochimiques ou biophysiques de précision moléculaire. La possibilité de sonder les événements ex vivo, in vivoet in vitro en utilisant les mêmes molécules de CDO prépare le terrain pour démêlé des événements qui se produisent en vivo à l’aide de techniques qui ne sont possibles qu’à appliquer sur ex vivo ou vitro échantillons11,17. Un modèle de structure récemment déclarés haute résolution montre que le CDO pentamérique ZLEA (pFTAA) lie dans une cavité formée par les chaînes latérales alignées parallèle à l’axe de fibrilles s’étendant sur 6 brins bêta parallèles en Registre18, démontrant qu’il est possibilité d’acquérir des connaissances de résolution atomique sur les entités de la cible de CDO. Essentiellement le mode de liaison cavité et la liaison des pFTAA est semblable au rouge Congo19, dictée par un sillon bordé de répétitif positif chargé Lys-chaînes latérales. L’affinité de LCOs semblent être mieux par rapport au rouge Congo probablement due à la flexibilité de la chaîne et de fortes interactions de van der Waals des atomes de soufre des anneaux thiophène vers la cavité hydrophobe. La détection des espèces prefibrillar (avant répond ThT)5,20 apparaît dépend de feuilles β répétitives, composés d’en registre parallèle-bêta-brins, qui, pour hFTAA en deux unités thiophène plues de pFTAA serait couvrent le croisement de jusqu’à 8 bêta-brins.

Le protocole de coloration nécessite une attention aux pannes dans les étapes suivantes : (i) Fixation : fixation étendue d’échantillons de tissus peut perturber la structure amyloïde et limiter la possibilité de détecter des variations dans les spectres de fluorescence induites par distorsion de conformation de la molécule hFTAA. Fixation légère des cryosections de matériel frais congelé est préférable pour atteindre une résolution spectrale optimale. Cependant, hFTAA va tacher et réagissent en amyloïde dans les tissus fixe mais avec efficacité réduite et moins variation spectrale. (ii) exposition de l’épitope : avant le traitement du tissu obtenir une exposition épitope pour liaison anticorps pourrait réduire occasionnellement la possibilité pour les hFTAA lier à cause de perturbé la structure amyloïde. Si il s’agit d’un problème et l’épitope exposition est une étape cruciale dans l’anticorps souillant le protocole, en utilisant des sections consécutives d’anticorps et hFTAA, respectivement sont envisageables. (iii) overstaining : hFTAA est extrêmement sensible. Solutions de travail doivent être maintenues à concentration faible nM. Diminuer la concentration de hFTAA si la coloration de fond est un problème. Si les éléments qui unissent les hFTAA sont rares dans le tissu, un excès de hFTAA peut agréger et s’accumulent dans le milieu de montage. Ceci est reconnu comme la fluorescence ne figurant pas dans le plan focal du tissu lui-même. Si cela apparaît, plonger la lame montée dans du PBS jusqu’à ce que la lamelle couvre-objet peut être glissé de la section, laver avec du PBS et remonter avec les frais de montage et une nouvelle lamelle couvre-objet. (iv) filtre basé d’imagerie : imagerie de fluorescence pour la plupart spectralement résolue à l’aide de filtres passe longue ou plusieurs canaux de détection nous décrivons. hFTAA peut être également surveillée à l’aide de filtres passe courte. S’il vous plaît être conscient que cela va diminuer le contraste et abolir les possibilités afin de détecter de multiples couleurs.

Au cours des dernières années, il est devenu évident que comme outils de recherche, LCOs fluorescents, et en particulier hFTAA montrent des propriétés très prometteuses. Résultats ont été démontrés pour une grande variété de protéines et états pathologiques, allant de hFTAA détection des agrégats à l’intérieur des cellules (tau, myositis de corps d’inclusion), amylose systémique d’amyloïde sérique A, transthyrétine, chaînes légères d’immunoglobuline (kappa et lambda) seminogelin 1, prion protéines (y compris les échantillons cliniques)21, polypeptide amyloïde d’îlot et insuline7,15. Un facteur limitant pour la mise en œuvre de hFTAA comme outil de diagnostic, c’est que la microscopie de fluorescence n’est pas largement utilisée dans les laboratoires de pathologie amyloïde systématique. En outre, sa n’est pas facilement disponible dans la clinique. Cependant, hFTAA coloration amyloïde et la microscopie de fluorescence ont été utilisés dans les laboratoires cliniques dans un microscope à fluorescence basée filtre et doitêtre considérée comme une méthode de diagnostic gratuite. Cela a été récemment démontrée sur des biopsies du canal carpien avec la transthyrétine et fait l’objet à l’aide de paramètres de base pour la fluorescence dans un mode automatisé22.

En outre, en plus de diverses protéines, fluorescence hFTAA reconnaît une grande variété de types de fibrilles et pré fibrillaires amyloïdes agrégats, par exemple, espèces fibrillaire de voie ont été détectés et caractérisés. Dans cette publication, nous avons démontré un CDO sur différents types d’échantillons à l’aide de trois techniques de microscopie. L’utilisation de synthèse contrôlée a permis le développement de LCOs pour polyvalent détection de cibles de biomoléculaire, par exemple, enregistrement des interactions de surface plasmon resonance (SPR)23 et radiomarquage pour l’émission de positron 24de positons (TEP).

A ce jour, plus de 25 différents LCOs avec ont été publiés. Une utilisation accrue de LCOs pour l’imagerie des dépôts amyloïdes augmentera les connaissances et la compréhension de comment ces agrégats associés à la maladie assemblent, démonter et interfèrent avec les organes et les individus dans lequel ils résident.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Mikael Lindgren et Chanan Sluzny pour obtenir des conseils sur la microscopie de fluorescence et Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, par Westermark et Kurt Zatloukal pour leur contribution à des sections de tissu ou de micrographies affichées dans cette publication. La collecte des données présentées ci-après a été financée par les contributions de la Fondation suédoise de cerveau (Hjärnfonden), l’association suédoise d’Alzheimer (Alzheimerfonden), le Conseil de recherche suédois (VR), l’association Göran Gustafsson, Georg & Astrid Olsson, UE FP7 santé projet LUPAS et l’Université de Linköping.

Materials

hFTAA/Amytracker545 Ebba Biotech
Dako fluorescene mounting medium Agilent technologies GM304
LeicaDM6000 Leica
Lumen 200 Prior
Spectraview system ASI spectral imaging
Spectraview software ASI spectral imaging
LSM780 Zeiss
Zen 2010b v6.0 software Zeiss
FLIM system Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514 Zeiss
Tunable Laser In Tune Zeiss
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References

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Citer Cet Article
Nyström, S., Bäck, M., Nilsson, K. P. R., Hammarström, P. Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56279, doi:10.3791/56279 (2017).
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