个性化肽阵列在器官移植 HLA 抗体检测中的研究
Summary
器官捐献者与受体对人白细胞抗原 (HLA) 序列的不匹配是器官移植中抗体介导的排斥反应的主要原因。在这里, 我们提出了使用自定义抗原阵列, 根据个别捐赠人的 hla 序列, 以探测 anti-donor hla 抗体在器官接受者。
Abstract
在器官移植中, 移植物的功能和寿命关键依赖于控制人白细胞抗原 (HLA) 的免疫排斥反应的成功。组织相容性指导原则是基于抗 hla 免疫的实验室测试, 它要么是预先存在的, 要么是从头生成的 hla 抗体, 构成了主要的移植屏障。目前的测试是建立在一个 single-antigen 珠 (审计) 平台上使用一套固定的〜100预选的重组 HLA 抗原探针移植血清。然而, 在人类中存在着一个更大种类的 hla 类型, 没有两个人, 除了相同的双胞胎谁可以共享相同的 hla 序列组合。虽然先进的 hla 打字和直接测序技术可以准确地捕捉到捐赠者和受体 hla 之间 DNA 序列中的任何不匹配, 但由于其序列表征的多样性, 它无法精确检测抗体特别反对捐献者 HLA 不匹配。我们试图开发一种互补的方法, 使用不同的技术来检测和表征 anti-donor HLA 抗体在个性化的基础上。该筛选工具是一种自定义的肽序列的捐助者 HLA 派生的移植血清的器官受体, 以评估的风险, 抗体介导的拒绝。在一个单一的阵列为一个捐助者-受体对, 多达600独特的肽是根据捐赠人的 HLA 蛋白序列, 每多肽携带至少一个不匹配的残留在 15-氨基酸序列。在我们的实验中比较移植血清对这些阵列的抗原模式, 我们能够检测到抗 HLA 信号的分辨率, 这也使我们能够确定所涉及的免疫表位。这些个性化抗原阵列允许高分辨率检测器官移植中供体特异的 HLA 表位。
Introduction
在世界各地例行进行的器官置换治疗挽救了数百万人的生命。固体器官移植每年在美国约有100患者发生, 而在 waitlists, 由于供应严重短缺, 仍有更多的人接受捐赠器官 (根据该机构提供的资料采购和移植网络-OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov)。器官移植是高度规范的, 以减少器官的浪费和拯救生命, 但用于告知这些规定的科学工具的有效性是有限的。例如, 科学界充分认识到 HLA 分子的高度多态性和使用高分辨率打字和序列类型 (SBT) 的 DNA 的精确基因测试, 这些都是近几年才发展起来的1, 2. 然而, 同种测试方法尚未能够产生各种 HLA 序列作为抗原探针。目前的标准测试使用的是100位抗原的一个恒定的面板, 由 HLA、a、B、C、DQ、DP 和 DR 序列的常见变体组成, 其中3,4,5,6。通常, 实际捐赠者的 HLA 序列不包括在测试小组中, 强迫移植医生和外科医生根据捐赠者的实际序列和相应的 “标准” 的共同的相似性推断供者特定的反应。测试集7,8。因此, 对基于抗体测试结果的拒绝风险进行可靠估计是有挑战性的9,10,11,12。因此, 迫切需要13,14来进行抗体的新的个人自定义测试。
HLA 基因编码的主要组织相容性复合体 (MHC) 受体, 在免疫应答的关键功能6。HLA 基因是已知的最多态基因的人类基因组6。由于 HLA 基因的 DNA 测序策略的快速发展, 新的位变种 (或简称为等位性) 正被发现在一个爆炸性的速率15,16。到 2017年3月, 16755 已证实的等位基因已存入 IMGT/HLA 数据库 (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), 其中12351为 I 类和4404类。与此形成鲜明对比的是, 在标准 single-antigen 珠 (审计局) 检测中, 仅有超过100个不同的等位基因被代表, 这通常用于检测器官移植中的抗体。该方法是建立在一个 Luminex 平台上使用流式细胞仪。由于化验采用了一组不变的抗原, 除了小批量到间歇变化在生产中, 抗血清测试可以在个人和实验室之间进行强有力的标准化5。然而, 这项测试无法捕获所有的抗体, 特别是当捐献者的序列不在审计组的时候。虽然根据真实序列定制的捐赠者抗原的生产是可取的, 但在简化必要的生产和测试程序方面仍然存在技术上的挑战。
我们最近在肾脏移植患者的可行性研究中描述了一种替代方法17。该方法采用多肽抗原, 以阵列的形式来探查各科的前后移植血清。每个阵列都是使用点合成方法自定义18,19,20,2122,23 , 生成多肽抗原, 每15氨基酸的长度, 完全基于各自的器官捐献者的 HLA 等位基因 A, B, C, DQA1, DQB1 和 DRB1。用标准的 n-芴甲氧羰基-化学22在纤维素膜上进行斑点合成, 并可与全自动机器人系统19、21并行生成数百个自定义多肽。膜阵列可经受多次剥离和 reprobing 循环。在我们的回顾性研究17中, 我们检测到了在时间序列中收集的存储移植血清 (即移植前后的即) 中抗原模式的变化。本文介绍了该工作流的技术协议, 包括阵列设计、制造、抗血清探测和结果分析。该方法的目的是检测抗体对特定的线性表位移植捐赠人的 HLA 分子。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文所描述的斑点阵列的设计是为了对器官捐献者 HLA 抗原的移植同种特异性进行实验研究。与目前广泛应用于临床的审计方法相比, 抗原阵列法在其灵活设计中具有很大的优势, 能够适应单个捐献者的真实 HLA 序列。新的平台利用快速推进的 DNA 测序技术的潜能, 很快就能够产生准确的 HLA 位序列读数, 而不含糊不清16,27和指定数据库的潜力存储库 HLA 序列…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢加拿大西部大学的肖恩. 李和邢力对 SPOT 阵列产品的帮助。我们感谢在组织相容性核心的工作人员和西北大学综合移植中心提供样品服务。这项工作得到了部分支持, 西北纪念医院的辅助委员会, 并由一个教师启动基金由西北大学提供给 jj。
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
References
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD–the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
- Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients – Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great?. Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
- Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
- Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
- Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
- Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
- Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation–Worth the Risk?. N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
- Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
- Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem?. Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
- Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about?. Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
- Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
- Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing – getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
- Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
- Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
- Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
- Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
- Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
- Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
- Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
- Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
- Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
- Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
- Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).
