JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Published: October 30, 2017
doi:
10.3791/56274
,
1Center for Stem Cell Biology and Engineering,University of California, Santa Barbara

Summary

Bu iletişim kuralı, retina pigment epitel hücreleri (RPE) pluripotent kök hücre üretmek açıklar. Yöntem farklılaşma kök hücre içine olgunlaşmamış RPE on dört gün ve olgun, fonksiyonel RPE üç ay sonra büyüme faktörleri ve küçük moleküller bir arada kullanır.

Abstract

Pluripotent kök hücre farklılaşma içine retina pigment epitel hücreleri (RPE) yönlendirmek için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır. Bir detaylı ve kapsamlı protokol sağlama amaçlı açıkça her adım göstermek için ve bu alanındaki araştırmacılar için hazır olmak için var. Bu iletişim kuralı RPE homojen bir katmanda gerekli en küçük veya Hayır manuel diseksiyon ile sonuçlanır. Burada sunulan yöntem için etkili olduğu gösterilmiştir indüklenen pluripotent kök hücreler (IPSC) ve insan embriyonik kök hücreleri. Ayrıca, uzun süreli depolama izin ara cep bankaların dondurma için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan RPE IPSC çanak içinde hastalık modelleme veya klinik uygulama için yararlı olabilir.

Introduction

Retina pigment epiteli photoreceptors için çok önemli destek sağlayan bir monolayer Pigmentli hücreleri olduğunu. Retina pigment epitel hücreleri (RPE)-si olmak çok sayıda görev ışık emilimi, besin ve iyon taşıma, Bisiklete binme, retinoid dahil vizyon, photoreceptor dış segment fagositoz ve büyüme faktörü salgı1. RPE ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve retinitis pigmentosa gibi görme, bir kaybı sonucu işlevi etkiler retina dystrophies çeşitli vardır. RPE nesil pluripotent kök hücrelerden bu göz hastalıkları anlamak için araştırma kolaylaştırabilir ve RPE sınırsız bir kaynağı hücre terapileri2için sağlar. Aslında, birden fazla klinik çalışmalar devam pluripotent kök hücreler3den türetilmiş RPE kullanıyorsunuz.

Bu farklılaşma protokolü ilk Buchholz4 tarafından tanımlanmıştır ve Clegg5önceden yayınlanmış yöntemine dayalı. Yordamı farklılaşmamış pluripotent kök hücreler RPE kader manipülasyon insülin büyüme faktörleri (IGF), temel fibroblast büyüme faktörü (FGF-2 puanı ile doğru yönlendirmek için normal vivo içinde gelişim sürecinin taklit eder. FGF-basic), dönüştürme büyüme faktörü beta (TGF-β) ve WNT yolları4,5. Protokol önemli ölçüde geç %97.77 ± %0,1 pre-melanosome protein (PMEL) pozitif hücrelerinin vermiştir ve koşullar xeno-Alerjik6,7‘ ye adapte protokolünde, WNT yolu agonist eklenmesi tarafından geliştirildi. Elde edilen RPE gösterilmiştir RPE işaretleri bilinen RPE büyüme faktörleri ile uygun polarite salgılar ve photoreceptor dış segmentleri8fagositoz taşımak için transkript ve protein düzeyleri, ifade etmek için. Bu, daha hızlı ve güvenilir–dan temel fibroblast büyüme faktörü8basit kaldırma dahil “kendiliğinden” iletişim kuralları farklılaşma protokolüdür. Ayrıca, RNA sıralama RPE bu iletişim kuralını kullanan elde edilen verileri göstermek için elde edilen daha yaygın spontan yaklaşım8kullanarak çok benzer. 14 günlük yöntem Mazzoni9 (Pigmentli, polarize, fagositik, sonrası Mitotik, çokgen)9tarafından bahsedilen “5 P’ın” uygun RPE oluşturur. Bu yordam birden çok Labs’de tekrarlanabilir kanıtlanmıştır iken, son yıllarda10,11,12 ‘ yayınlanmış birkaç ek yönlendirilmiş farklılaşma yöntem kabul etmek istiyorum , 13.

Protocol

1. hazırlık reaktifler gün 0 gün 14 iletişim kuralı için Aşağıdaki orta bileşenleri hazırlamak: 100 x N2 ek, 2 mL 1 mL ekleyerek yapmak 100 mL retina farklılaşma orta (RDM) 50 x B27 ek ve 100 gerekli olmayan amino asit (NEAA) Dulbecco 96 mL x 1 mL ' s değişikliğin gerekli orta/besin karışımı F12 9 (DMEM/F12). 1 M Nikotinamid (NIC) NIC eriterek 1.221 g 8 ml steril su, vortexing ve 10 mL steril su ile ses getiren olun 10 mL. Steril filtre çözümü. Aşağıdaki büyüme faktörleri ve küçük moleküller hazırlamak: rekombinant fare kafa sulandırmak, insan dickkopf WNT sinyal yolu inhibitörü 1 (DKK-1) ve IGF-1’e 100 µg/mL her %0.1 sığır serum albümin (BSA) fosfat tamponlu çözüm (PBS). Gerektiği gibi aliquot ve mağaza-20 ° c ilâ 3 ay için. Temel FGF-10 µg/mL ve rekombinant insan/mouse/fare aktivin A 100 µg/mL her PBS % 0,1 BSA için yeniden oluşturma. Gerektiği gibi aliquot ve-80 ° c ilâ 1 yıl için mağaza. Yeniden oluşturma SU 5402 (FGF reseptör özgü tirozin kinaz inhibitörü) ve CHIR99021 (glikojen sentaz kinaz 3, GSK-3β, engelleyici) 10 mm her Dimetil sülfoksit (DMSO). Aliquot ve mağaza-20 ° c ilâ 1 yıl ya da 6 ay için sırasıyla. Gün 0 ve/veya gün 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm (0.2 g EDTA PBS 1 litre başına), 1 X PBS- / – için aşağıdakileri elde olmadan kalsiyum veya magnezyum, pH 7,4 (PBS), 1 x tripsin benzeri ayrılma enzim (TDE), DPBS (Dulbecco ' s PBS), RPE destekleyen orta (RSM) ve Y-27632 dihydrochloride (kullanımı 10 µM). 2. Gün 0: Pluripotent kök hücre geçiş farklılaşma için günün Grow kök hücre kolonilerde Besleyici, serum boş koşulları için passaging önce yaklaşık % 80’i izdiham. Not: Bu adım optimize üzerinde tartışma ayrıntılı bilgi için bkz:. 12-şey plaka ekstraselüler matriks tabanlı hidrojel (ECMH) göre üretici önerileri ile kat. 1s için oda sıcaklığında veya gecede 4 ayarlamak için izin ver ° C. Aliquot RDM ve gün için gerekli büyüme faktörleri eklemeden önce 0 ve sıcak su banyosu 37 ° C için PBS- / – hacmi. EDTA oda sıcaklığına getirmek. 10 mM NIC, 50 ng/mL kafa, 10 ng/mL DKK-1 ve 10 ng/mL IGF-1 ile ısıtılan RDM 0 gün için gerekli büyüme faktörleri ekleyin. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri 100 µL NIC, kafa 5 µl, DKK-1’in 1 µL ve IGF-1’in 1 µL eklemek RDM için 10 mL. Morfoloji farklılaşma için passaged kök hücreleri temel alan tüm farklı koloniler kaldırmak için seçin. P10 damlalıklı ipucu farklılaşmış hücreler el ile kaldırmak için kullanın. Not: Fibroblastic hücreler arasında kolonileri hem de opak hücrelerin kolonileri içinde kaldırılacak farklılaşmış hücreler gösterir. Farklılaşmış hücreler hakkında ayrıntılı bilgi için bkz. 6-şey plaka tek iyi bir 12-şey plaka (1:4) 4 kuyu geçiş. Not: Bu aşamada kök hücre passaging Ayrıntılar için tartışma bakın. Kök hücre kök hücre ortamından Aspire edin ve wells Önceden ısıtılmış PBS- / – 2 mL ile bir kez yıkayın. Aspire PBS- / – ve durulama her EDTA 1 mL 6-şey plaka kuyu başı ile de üç kez. Yavaşça plaka eğilme ve EDTA Aspire edin. Plaka zamanından önce hücreleri kaldırma önlemek için herhangi bir şekilde tahrik değil. Sonra üçüncü yıkama 1 mL EDTA ekleyin ve mahalle için 3-5 dk içinde oda sıcaklığında kuluçkaya. Plaka bu kuluçka sırasında rahatsız etmeyin. EDTA Aspire edin ve RDM 0.5 mL ilave orta ile 1 mL numaralı seribaşı şey başına ekleyin. Örneğin, 1 de 6-şey plaka ile RDM 4.5 mL 12-şey plaka 4 kuyu plaka için yıkayın. Hücre kazıyıcı yavaşça hücreleri ayırmak için kullanın. Konik tüp içinde tüm hücreleri toplamak ve RDM hücrelerde yukarı ve aşağı 5 kere pipetting tarafından triturate. Hücre büyük kümeleri ayırmak, ama tek hücre süspansiyon için triturate değil. Damlalıklı hücrelerde eşit olarak dağıtın. Hızlı bir şekilde yatıştırıldı plaka engellemek için bu adımı tamamlamak. Tohum hücreleri (hücre süspansiyon iyi başına 1 mL) ECM kaplı 12-şey plakaları. İleri geri hücreleri kuyuları boyunca eşit olarak dağıtmak için plaka eğ. Yavaşça bir hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO 2 orta değiştirmek kadar yerleştirin. Tam olarak ne zaman unutmayın. Her gün aynı anda değişiklik orta. 3. Gün 1-14: büyüme faktörleri ek gün 1: Bütün wells (iyi başına 1 mL) medyada değiştirmek gün 0 (bkz. Adım 2.4) büyüme faktörü bileşimi ile RDM kullanarak. Gün 2: Orta RDM (iyi başına 1 mL) 10 mM NIC ile 5 ng/mL FGF-temel, 10 ng/mL kafa, 10 ng/mL DKK-1 ve 10 ng/mL IGF-1 kullanarak değiştirin. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri, NIC, FGF-Basic 5 µL, kafa 1 µL, DKK1 1 µL ve IGF1 1 µL 100 µL RDM için 10 mL ekleyin. Gün 4: RDM (iyi başına 1 mL) kullanarak orta 100 ng/mL aktivin A, 10 ng/mL DKK-1 ve 10 ng/mL IGF-1 ile değiştirin. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri, aktivin A, DKK1 1 µL ve IGF-1’in 1 µL olan 10 µL RDM için 10 mL ekleyin. Not: Bu aşamada hücreleri Konfluent gözlemlemek. Gün 6: 5402 RDM (iyi başına 1 mL) kullanarak orta 100 ng/mL aktivin A ve 10 µM SU ile değiştirin. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri, aktivin a 10 µL ekleyip 10 µL SÜ RDM 5402-10 mL. Gün 8, 10 ve 12: RDM (iyi başına 1 mL) kullanarak orta 100 ng/mL aktivin A, 10 µM SU 5402 ve 3 µM ile değiştirin CHIR99021. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri, aktivin A, SU 5402 10 µL ve CHIR99021 3 µL olan 10 µL RDM için 10 mL ekleyin. 4. Gün zenginleştirme RPE 0 geçirilmesi için kat büyüme faktörü ile 6-şey plaka azaltılmış ECMH üretici öneriler göre. 1s için oda sıcaklığında veya gecede 4 ayarlamak için izin ver ° C. Aliquot gerekli DPBS hacmi ve RDM 1 mL zenginleştirme ve sıcak su banyosu 37 kuyu başına ° C. Bring TDE oda sıcaklığında ve sıcak gerekli hacmiyle RSM, antimikrobiyal reaktif ve Y-27632 37 ° c Ekle antimikrobiyal reaktif ve 0.5 x ve 10 µM besteleri sırasıyla için RSM alma Y-27632. Bu orta eki geliştirmek için ilk 4-7 gün boyunca kullanın. Tüm aspiratı harcanan orta Kuyu yapımı ve Önceden ısıtılmış RDM (hiçbir büyüme gerekli faktörleri) kuyu başına 1 mL ekleyin. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, el ile incelemek ve uzak bir P10 damlalıklı ucu kullanarak tüm RPE olmayan hücreleri kazımak. Not: temsilcisi sonuçları örnekler için bkz:. Sonra diseksiyon, RDM Aspire edin ve tüm enkaz cep. Önceden ısıtılmış DPBS iyi başına 1 mL ile iki kez yıkayın. TDE 0.5 mL 12-şey plaka kuyu başına ekleyin ve 5 dk. yavaşça hücreleri plaka kaldırmak için hücre kazıyıcı kullanım için 37 ° C’de kuluçkaya. P1000 damlalıklı yavaşça aşağı yukarı 3 – 4 kez için pipetting tarafından hücre/TDE süspansiyon triturate kullanmak tek tip süspansiyon oluşturmak. Hücre/TDE süspansiyon 1:10 ‘ Y-27632 olmadan Önceden ısıtılmış RSM oranında seyreltin. Santrifüj kapasitesi 173 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücre süspansiyon. Hücre Pelet ortamından Aspire edin ve RSM hücrelerde 10 µM ile resuspend Y-27632 (başına 1 mL zenginleştirilmiş iyi). Bir naylon mesh hücre süzgeç ile 40 µm gözenekleri kullanarak hücreleri süzün. Bir hemasitometre kullanarak belirtilen birim hücreleri saymak ve gergin çözüm hücrelerde konsantrasyonu hesaplayın. Tohum hücre büyüme faktörü üzerinde azaltılmış ECM / galvanizleme levhalar 1 x 10 5 hücreleri/cm 2 ‘ RSM 4 mL 10 µM ile de Y-27632. Yerine RSM ile 10 µM Y-27632 hücre tohum sonra 48 h ve medya yerine 3-4 günde (örneğin Pazartesi ve Perşembe günleri) devam ediyor. 10 µM yerine yapmak 4-7 gün sonra Y-27632. 28-35 gün 37 ° C ve % 5 CO 2 olgun hücrelere izin. RSM yerine 3-4 günde (örneğin Pazartesi ve Perşembe günleri) devam. 5. Olgunlaşma: Geçiş 1 ve 2 RPE / Not: parantez içinde gösterilir gibi birimler için de, bir 6-şey tabak ya da bir T75 şişesi 1 belirtilen. Arasındaki gün 28-35 geçit 0, bir 6-şey plaka (T75 şişesi) ECMH ile üretici öneriler göre kat. Aliquot hacmi DPBS ve RSM gerekli ve sıcak su banyosu 37 ° C. getirmek TDE oda sıcaklığına. Aspiratı harcanan orta kuyulardan ve yıkama de iki kez 2 mL (10 mL) Önceden ısıtılmış DPBS. Not: 10 µM kullanmayın Y-27632. Aspire DPBS ve 1 mL (5 mL) TDE ekleyin. 5 min için 37 ° C ve % 5 CO 2 kuluçka yerleştirin. Kuluçka sonra hücreleri onaylamak için ters bir mikroskop görünüm hücrelerdeyse müteahhitlik ve ayırma. Bir uygun boyutlu hücre kazıyıcı kullanarak yavaşça çıkarın hücreleri iyi veya cep şişesi derinliklerinden. P1000 ipucu (10 mL serolojik damlalıklı) hafifçe hücre/TDE süspansiyon yukarı ve aşağı için 3 – 4 kez triturate için kullanın bir tek tip süspansiyon oluşturmak. Hücre süspansiyon 1:10 RSM sulandırmak. RSM iyi/şişeye durulayın ve seyreltilmiş hücre süspansiyon eklemek için 2 mL (5 mL) rezerv. Not: enzim çekim hızı 25 dk. aşmasına izin vermez Hücre süspansiyon 173 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet ortamından Aspire edin ve 1 mL (5 mL) RSM hücrelerde resuspend Bir naylon mesh hücre süzgeç ile 40 µm gözenekleri kullanarak hücreleri süzün. Bir hemasitometre kullanarak belirtilen birim hücreleri saymak ve gergin çözüm hücrelerde konsantrasyonu hesaplayın. Tohum hücreleri 1 x 10 5 hücreleri/cm 2 4 mL (15 mL) RSM’de ECMH kaplı Tabaklarda. 30 gün boyunca olgun hücrelere izin. Her 3-4 gün RSM değiştirmeye devam. Geçiş 1-2 hücreleri geçiş ile 30 gün (Adım 5.2-5.11) Yukarıdaki yordamı yineleyin. 6. Bir ara hücre Bankası oluşturma: dondurma, geçiş 2 gün 3-5 RPE Not: onlar (~ ) subconfluent ve pigment kavuştular değil iken hücreleri Cryopreserve. Hücre sayısına göre 3 x 10 6 hücre/mL bir konsantrasyon hücreleri resuspend için gerekli DMSO ile dondurma orta hacmi hesaplamak. 5.2-5,8 adımları izlemeniz. 3 x 10 6 hücre/ml % 10 DMSO ile dondurma ortamda hücre Pelet resuspend ve hücre süspansiyon 1 mL 1.2 mL kriyojenik şişeleri için transfer. Kriyojenik şişeleri-1 ° C/dak serin ve-80 ° C’de gecede yerleştirmek için tasarlanmış bir dondurucu kapsayıcısına getirin. Uzun süreli depolama için sıvı azot transfer. Not: Bu hücreler çözdürme üzerine geçiş 3 olacaktır. 30 gün önce karakterizasyonu için hücreleri kültür. Tohum geçiş 3 RPE 1.5 x 10 cm 2 çözme üzerine 5. 2 , 4 , 6 , 7

Representative Results

Bu yöntem bir homojen, Pigmente ve tetrahedron monolayer RPE, üretimde sonuçlanır. Zaman Çizelgesi’Resim 1 Resim 2′ tasvir görüntüleri karşılık gelir. Şekil 2Agösterildiği gibi kök hücre kolonileri sıkı bir şekilde tanımlanmış kenarlar ve hiçbir fibroblastic hücreler arasında kolonileri ya da opak hücrelerin kolonileri içinde paketlenmiştir. Şekil 2B subconfluent olgunlaşmamış RPE bir gösterimini sağlar. Hücreleri zaten bu aşamada Konfluent ise, farklılaşma süreci için kritik olan projeksiyonlar genişletemezsiniz. Ağır subconfluent olan hücrelere bir monolayer kurmak ve sıkı kavşaklar, epitel ile karakteristik oluşturmak mümkün olmayacaktır. Bu izdiham en iyi duruma getirmek hakkında ayrıntılı bilgi tartışma bölümünde özetlenen. Şekil 2C gösterir Sigara-Bu farklılaşma işlem sırasında ortaya çıkabilecek RPE en yaygın iki tür morfolojisi: sinirsel ya da fibroblastic yamalar. Tanımlanan, fibroblastic benzeri yamalar üzerinde diseksiyon mikroskop neredeyse yarı saydam ise sinir bu yamaları diseksiyon mikroskop üzerinde özellikle opak görünür unutmamak gerekir. Bu alanlarda bir doku kültürü plaka üzerinde bir bileşik ışık mikroskobu ve diseksiyon mikroskop üzerinde daha kolay tanımak için bir etanol geçirmez laboratuvar kalemle işaretlemek yararlı olabilir. Rakamlar 2D-F karakteristik parlak sınırları, Arnavut kaldırımı morfoloji ve RPE sağlıklı, olgunlaşan kültürünün belirtmek pigmentasyon gösterir. Şekil 3 tam olgun RPE faz kontrast ve aydınlık alan mikroskobu tarafından tasvir farklı görünümünü göstermek için daha yüksek bir büyütme görüntüdür. Geçit 3 gün 30, hücrelerin RNA ifade, protein ifade, büyüme faktörü salgı ve fagositoz2,4,6 dahil olmak üzere önceki yayınlarda açıklanan karakterizasyonu için hazır ,7. Bu karakterizasyonu bu Albümdeki temsil hücreleri sadece Pigmente ve tetrahedron, ama aynı zamanda fagositik, sonrası Mitotik ve polarize olduğunu göstermektedir. Şekil 1:. Zaman çizelgesi büyüme faktörleri eklenmesi ve RPE olgunlaşma için. Büyüme faktörleri 12-şey plakaları için 0-14 günden eklenir. RPE olgunlaşması kültürlü 6-şey plakaları veya zenginleştirme günden itibaren T75 Şişeler için 30 gün sonrası tezcan (passage 3 gün 30). Oklar, enzimatik hücre passaging gösterir. (A-E) aşağıda Şekil 2Albümdeki zaman çizelgeleri karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: temsilcisi morfoloji ve RPE olgunlaşması izdiham. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler hemen önce farklılaşma(a)passaging. Olgunlaşmamış RPE hücrelerinin subconfluent günde 2 (B) ve çekme Kaldır zenginleştirme 14 gün önce; RPE yamalar (beyaz oklarla gösterilen) yamalar veya opak “kurdele” (C) olarak görünür. Geçit 0, 1 ve 3 gün 30, RPE (D, E ve F). Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: olgun RPE passage 3: gün 30 Faz kontrast(a)tasvir tetrahedron morfoloji ve pigmentasyon parlak-alanında (B) tasvir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu iletişim kuralı, retina pigment epitel hücrelerinden pluripotent kök hücre üretmek açıklar. Yöntem her iki insan embriyonik ve İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden bir besleyici, serum boş kültür yöntemi kullanarak optimize edildi. İnsan embriyonik kök hücreleri 1998 yılında ilk yalıtım ve İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) türetme 2007 yılından bu yana çok sayıda kök hücre kültür yöntemleri olmuştur14,15,16geliştirilen, 17. Bu yöntemler bu farklılaşma duyarlı kök hücre kolonileri üretmek için yeterli olmalıdır. Düzgün türetilmiş ve bakımlı pluripotent kök hücreler için bu yöntemin uygulanabilirliği için bilinen hiçbir sınırlamalar vardır.

Gün 0 farklılaşma (Adım 2.5) kök hücrelere ve işleminin (Adım 4.5) el ile diseksiyon gün 14, potansiyel ihtiyacını passaging en önemli adımlardır. Farklılaştırılmış hücrelerin kök hücre kolonileri kaldırmak için seçilmesinde Kent18Albümdeki bakın. Belirtildiği gibi bu iletişim kuralı18başlamadan önce kaldırılması gerekir farklılaşmış hücreler fibroblastic hücreler arasında kolonileri ve opak hücrelerin kolonileri içinde gösterir. Sadece farklılaşmamış, sıkıca paketlenmiş kolonileri tanımlı kenarları ile farklılaşma için passaged.

Kök hücreleri iyi (Adım 2.6.7) tohumlari kök hücreleri tek hücre süspansiyon üzerine geçiş içine triturated değil ve doğru bir hemasitometre kullanarak sayılır olamaz karmaşıklaşır. Yaklaşık % 80’i Konfluent kök hücrelerin passaging 1 de 6-şey plaka için 12-şey plaka 4 kuyu belirtilir. Büyüme hızı gibi kök hücre hatları arasındaki farklar ne kadar hızlı olgunlaşmamış RPE ulaşmak izdiham gün 0 ile 4 arasında etkileyebilir. Kök hücre RPE ne olursa olsun kesin izdiham üretecek, ama bu aşamada hücreleri çok seyrek olan hücre verim olumsuz etkilenecektir. Olgunlaşmamış RPE hücrelerinin yaklaşık % 40-50 birleşmesi gün 4 gün 1 ve neredeyse % 100 birleşmesi olmalıdır. Hücreleri Konfluent monolayer gün 4 veya 6 üreten değil, protokol daha yüksek bir tohumlama yoğunluğu gün 0 saat yinelenmelidir. Örneğin, 1 de 6-şey plaka / 12-şey plaka 4 kuyu için gün 0 pasajlı ve olgunlaşmamış RPE % 100 birleşmesi gün 4 değilseniz, bir 1:3 veya 1:2 geçit gün 0 tohum azaltmak veya kök hücreler daha Konfluent olmak izin passaging önce. Ne zaman birden fazla hücre satır karşılaştırma tutarlı bir tohumlama yoğunluğu kurmak için önemlidir.

Gün 14 Manuel diseksiyon adımda yalnızca sigara RPE hücrelerinin kültürü (şekil 2C) mevcut olduğunda gereklidir. İletişim kuralına CHIR99021 ek beri birçok pluripotent kök hücre hatları küçük hiçbir manuel diseksiyon gerektirir. Bazı hazırlıklar sinirsel yamalar daha yüksek insidansı olması ve bu hücreleri kaldırmak için önemlidir. RPE passage 3 0 geçitle, uygun değilseniz, tüm sigara RPE hücrelerinin kaldırmak için yeterli zaman ayırdığınız farklılaşma Protokolü tekrar mümkündür. Bu kez olmaz, ama burada gün 14 diseksiyon basamakta gerektiğinde iyileştirilebilecek Not belirtilir.

Farklı maliyet yanı sıra kültür yöntemleri, verimliliği, miktar RPE farklılaşma protokolleri çeşitli ve işlevsel değerlendirme, ikincisi olan oldu iyice2gözden. Biz burada onun etkinlik, adaptasyon ve hücre hatları4,7,8geniş bir yelpazesi için Uygulanabilirlik nedeniyle detaylı 14 günlük yöntemi tercih ederler. Bu iletişim kuralı dondurma adımda da çok çok değişkenlik deneylerde kaçınarak ileride kullanmak üzere bir ara cep banka oluşturmanın önemli bir avantaj sağlar. 12-şey plaka sadece 4 wells ile başlayarak, geçit 0, 6-şey plakaları ve geçiş 1 ve 2, T75 şişe içine genişletmek mümkündür. Hücreler hala subconfluent ve pigment, kavuştular değil zaman geçit 2 gün 3-5, onlarca milyon hücre cryopreserve ve geçiş belirlenen 3 günü 30 olgun RPE çözülme, RNA ifade, protein ifade, büyüme faktörü kontrol etmek mümkündür salgılanması, fagositoz, vb. Biz de protokolleri RPE en fazla 13 pasajlar 19için genişletmek için kurduk.

Dört gözle, bu yöntem IPSC oküler hastalik modelleme ve RPE nesil hücresel tedavi için faydalı olacaktır. IPSC hastalığı modelleme açısından bu iletişim kuralı şu anda laboratuarda aynı hastanın sigara düzeltilmiş denetimleriyle CRISPR düzeltilmiş satırlarından RPE üretmek için kullanılıyor. Ayrıca, bu iletişim kuralını sentetik yüzeylerde ve bir hücresel tedavi için gerekli en iyi üretim uygulamaları yapıştırma için yararlı xeno-Alerjik koşulları için uyarlanabilir.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Garland Initiative tarafından desteklenmiştir görme, California Enstitüsü için rejeneratif tıp (CIRM; hibe DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 ve TG2-01151), Vermont Toplum Vakfı, Breaux Vakfı ve Körlük Wynn-Gund translasyonel araştırma hızlandırma programını mücadele Vakfı.

Materials

SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet Baker model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 6' Baker laminar flow biosafety cabinet
Dissection Hood Labconco Model 3970405 laminar flow bench top
dissecting microscope Nikon SMZ 1500 heated stage
air-jacketed CO2 incubator Sanyo MCO-17AIC 37 oC and 5% CO2
inverted phase contrast microscope Olympus IX53
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
DMEM/F12 Gibco 10565042
N2 Supplement Gibco 17502048
B27 Supplement Gibco 17504044
NEAA Gibco 11140050
Name Company Catalog Number Comments
Growth Factors and Reagents
Nicotinamide Sigma N0636
Recombinant mouse noggin R&D systems 1967-NG-025
Recombinant human DKK-1 R&D systems 5439-DK-010
Recombinant IGF-1 R&D systems 291-G1-200
FGF-basic Peprotech 100-18B
Recombinant human/mouse/rat Activin A Peprotech 120-14E
SU5402 FGF inhibitor Santa Cruz Biotechnology sc-204308
Name Company Catalog Number Comments
Substrates
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free Corning 356237 extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free Corning 354277 growth factor reduced ECMH
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
1X Versene (EDTA) Gibco 15040066
DPBS Gibco 14190250
1X PBS (no calcium, no magnesium) Gibco 10010023
TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) Gibco 12563011
X-VIVO 10 (RPE supporting medium) Lonza BW04-743Q
Y-27632 Tocris 12-541-0 (1254)
CryoStor CS10 BioLife Solutions 210102 cryopreservation medium
1.2 mL Cryogenic Vial Corning 430487
Mr. Frosty (freezing container) Nalgene 5100-0001 freezing container
Normocin Invivogen ant-nr-2 antimicrobial reagent
Name Company Catalog Number Comments
Other Equipment
Pipet-aid Drummond 4-000-101
12-well culture plate Corning CLS3516 Used during differentiation.
T75 flask Corning 430641 Used during RPE maturation.
6-well culture plate Corning CLS3513 Used during RPE maturation.
cell scraper Corning 08-771-1A Used during passages.
cell strainer Falcon 352340 Used during passages before cell count.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
  3. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).
  4. Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).
  5. Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration. Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).
  6. Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).
  7. Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate. Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).
  8. Leach, L. L., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).
  9. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  10. Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).
  11. Choudhary, P., et al. Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage. Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).
  12. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).
  13. Lane, A., et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).
  18. Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
  19. Croze, R. H., et al. ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium. Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).

Tags

Retinal Pigment Epithelial CellsHuman Embryonic Stem CellsInduced Pluripotent Stem CellsRetinal DifferentiationDirected DifferentiationStem Cell BiologyEye ResearchRPERetinal DevelopmentStem Cell Disease ModelGrowth FactorsSmall MoleculesExtracellular MatrixHydrogelEDTACell PassagingCell RemovalUndifferentiated Stem CellsEfficiencyEnrichment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (128), e56274, doi:10.3791/56274 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image