JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

Published: October 30, 2017
doi:
10.3791/56274
,
1Center for Stem Cell Biology and Engineering,University of California, Santa Barbara

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתאי גזע pluripotent. השיטה משתמשת בשילוב של גורמי גדילה מולקולות קטנות כדי לכוון את הבידול בתאי גזע לתוך RPE ילדותי בעוד 14 ימים ו- RPE בוגרת, פונקציונלי לאחר שלושה חודשים.

Abstract

אנו מתארים שיטה חזקה לכוון הבידול של גזע pluripotent לתוך הרשתית פיגמנט בתאי אפיתל (RPE). מטרת מתן פרוטוקול מפורט וממצה היא בבירור להדגים כל שלב כדי לבצע זה זמינים חוקרים בתחום. פרוטוקול זה תוצאות שכבה הומוגנית של RPE עם ניתוח מינימלי או ידני לא צריך. השיטה המוצגת כאן הוכח להיות יעיל עבור המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSC), תאי גזע עובריים. בנוסף, אנו מתארים שיטות הקפאה קריוגנית הבנקים תא ביניים המאפשרים אחסון לטווח ארוך. RPE שנוצר באמצעות פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי עבור מידול המחלה-ב–תבשיל iPSC או יישום קליני.

Introduction

אפיתל הפיגמנט ברשתית הוא טפט של תאי פיגמנט מספק תמיכה מכרעת עבור photoreceptors. בתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) יש פונקציות רבות בחיזיון, לרבות קליטת האור, תחבורה מזין, יון, retinoid רכיבה על אופניים, קולט אור phagocytosis קטע החיצוני, ואת הגידול גורם הפרשת1. ישנם מגוון של dystrophies ברשתית המשפיעות על הפונקציה RPE ולהוביל לאובדן הראייה, כולל הקשורות לגיל ניוון מקולרי, רטיניטיס פיגמנטוזה. דור של RPE מתאי גזע pluripotent עשוי להקל על מחקר כדי להבין את אלה מחלות עיניים, והוא יכול לספק מקור מוגבל של RPE עבור טיפולים תא2. למעשה, מחקרים קליניים מרובים לדרך משתמש RPE שמקורם בתאי גזע pluripotent3.

פרוטוקול בידול זה תוארה לראשונה על ידי בוכהולץ4 , התבססה על שיטת שפורסמו בעבר קלג5. ההליך מחקה נורמלי ויוו התהליך ההתפתחותי לכוון תאי גזע pluripotent מובחן לקראת גורל RPE באמצעות מניפולציה של גורמי גדילה אינסולין (IGF), בסיסי פיברובלסט גורם גידול (FGF-2; FGF-basic), הפיכת גורם הגדילה בטא (TGF-β), וחגיגת מסלולים4,5. הפרוטוקול היה משופר באופן משמעותי על ידי תוספת של אגוניסט מסלול ונ ט מאוחר בפרוטוקול, אשר הניב 97.77% ± 0.1% חלבון (PMEL) טרום-melanosome תאים חיוביים, הותאם ל תנאים נטול קסנו6,7. RPE וכתוצאה מכך הוכחו אקספרס RPE סמני ברמות התעתיק וחלבון, מפרישים גורמי גדילה RPE ידוע עם קוטביות המתאים, ולבצע phagocytosis של מקטעי החיצוני קולט אור8. פרוטוקול זה היא מהירה ואמינה יותר מאשר “ספונטנית” הפרוטוקולים של בידול המערבות הסרה פשוטה של בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה8. יתר על כן, רצפי RNA הנתונים מראים כי RPE להשיג באמצעות פרוטוקול זה הם דומים מאוד לאלו שהושגו באמצעות גישה ספונטנית נפוץ יותר8. השיטה 14 יום יוצר RPE שמתאימים 5 ה-פ’ של”שהוזכרו על ידי Mazzoni9 (פיגמנט, מקוטב, phagocytic, שלאחר mitotic, מצולע)9. בזמן הליך זה הוכיח להיות לשחזור במעבדות מרובים, אנו מאחלים להכיר מספר שיטות התמיינות מכוונת נוספים שפורסמו בשנים האחרונות10,11,12 , 13.

Protocol

1. הכנה של ריאגנטים עבור יום 0 14 יום של הפרוטוקול להכין בינוני הרכיבים הבאים: להפוך 100 מ של בידול ברשתית בינוני (RDM) על-ידי הוספת 1 מ”ל של 100 x N2 תוספת, 2 מ ל x B27 תוספת 50, ו 1 מ”ל של 100 x חומצת אמינו שאינן הכרחיות (NEAA) עד 96 מ”ל של Dulbecco ' s ששינה בינוני/מזין חיוני תערובת F12 9 (DMEM/F12). להפוך 10 מיליליטר nicotinamide 1 מ’ (NIC) על ידי המסת g 1.221 של ה-NIC ב 8 מ של מים סטריליים, vortexing להביא את אמצעי האחסון 10 מ”ל מים סטריליים. סטרילי לסנן את הפתרון. להכין מולקולות קטנות וגורמי צמיחה הבאים: לשקם הראש העכבר רקומביננטי, מעכב מסלול איתות של האדם dickkopf ונ ט 1 (DKK-1), ו- IGF-1 עד 100 µg/מ”ל כל אחד ב- 0.1% אלבומין שור (BSA) בתמיסה באגירה פוספט (PBS). Aliquot כנדרש וחנות ב-20 ° C עד 3 חודשים. לשקם FGF-basic 10 µg/mL, רקומביננטי האדם/עכבר/עכברוש Activin A µg/מ ל כל אחד ב- 0.1% BSA ב- PBS. Aliquot כנדרש וחנות ב-80 מעלות צלזיוס עד 1 שנה. סו לשקם 5402 (FGF ספציפיים קולטן טירוזין קינאז מעכב) ו- CHIR99021 (גליקוגן סינתאז קינאז 3, GSK-3β, מעכב) ל 10 מ מ כל דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). Aliquot וחנות ב-20 ° C עד 1 שנה או 6 חודשים, בהתאמה. להשיג את הפריטים הבאים עבור יום 0 ו/או יום 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון (0.2 גרם EDTA לכל 1 ליטר ל- PBS), PBS X 1- / – (PBS ללא סידן או מגנזיום, pH 7.4), 1 x כמו טריפסין דיסוציאציה אנזים (TDE), DPBS (Dulbecco ' s PBS), RPE תמיכה בינונית (RSM), Y-27632 (שימוש ב- 10 מיקרומטר) dihydrochloride. 2. יום 0: יום של מעבר לתאי גזע Pluripotent עבור בידול לגדול מושבות תאי גזע בתנאים ללא מזין, ללא סרום כדי כ- 80% הנהרות לפני passaging. הערה: ראה דיון לפרטים על אופטימיזציה שלב זה. מעיל צלחת 12-ובכן עם חוץ-תאית מבוססת-מטריקס הידרוג (ECMH) בהתאם להמלצות היצרן. מאפשרים להגדיר עבור 1 h בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס Aliquot כמות RDM ואת PBS- / – זקוק ליום 0 וחם באמבט מים עד 37 ° C לפני הוספת גורמי גדילה. להביא EDTA בטמפרטורת החדר. להוסיף את גורמי גדילה הדרושים ליום 0 RDM ומחוממת עם 10 מ מ NIC, 50 ng/mL הראש, 10 ng/mL DKK-1, ו- 10 ננוגרם למ”ל IGF-1. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 100 µL-nic, 5 µl של הראש, µL 1 של DKK-1 ו- 1 µL של IGF-1 עד 10 מ”ל של RDM. לבחור להסיר את כל מושבות הבדיל בהתבסס על מורפולוגיה מתאי גזע כי passaged עבור בידול. השתמש טיפ pipet P10 כדי להסיר באופן ידני את התאים הבדיל. הערה: תאים Fibroblastic בין מושבות, כמו גם את התאים האטומים בתוך המושבות לציין תאים יוסרו. ראה דיון לקבלת פרטים אודות תאים. בקטע טוב יחיד של צלחת 6-ובכן לתוך בארות 4 של צלחת 12-טוב (1:4). הערה: ראה דיון לפרטים על passaging תאי גזע בשלב זה. תשאף המדיום תאי גזע מתאי גזע. ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 2 מ של PBS מראש ומחוממת- / — תשאף PBS- / – ולאחר מכן לשטוף כל שלוש פעמים עם 1 מ”ל של EDTA לכל טוב של צלחת 6-ובכן. בעדינות להטות את הצלחת, וארוקן את EDTA. לא להתסיס את הצלחת בכל דרך להימנע בטרם עת מרימים את התאים. לאחר לשטוף את השלישי, להוסיף 1 מ”ל של EDTA, דגירה בטמפרטורת החדר בשכונה למשך 3-5 דקות. נא לא להפריע את הצלחת במהלך הדגירה הזה. וארוקן את EDTA ולהוסיף 1 מ”ל של RDM לכל זה להיות נזרע עם 0.5 מיליליטר בינונית נוספת. לדוגמה, לשטוף 1 טוב של צלחת 6-ובכן עם 4.5 מ ל RDM לצלחת על 4 בארות של צלחת 12-ובכן. להשתמש במגרדת תא לנתק בעדינות את התאים. לאסוף את כל התאים צינור חרוטי, triturate התאים RDM על-ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. מביצועם גושים גדולים של תאים, אך לא triturate אל תא בודד ההשעיה. להפיץ את התאים בשכבה אחידה pipet. להשלים שלב זה במהירות כדי למנוע reattachment לצלחת. זרע תאים על לוחות 12-ובכן מצופים ECM (1 מ”ל של השעיה תא לכל באר). להטות את הצלחת אחורה וקדימה להפיץ את התאים באופן שווה לאורך כל הבארות. הנח בעדינות בתוך חממה תרבות תא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 עד בינוני השינוי הבא. שימו לב הזמן המדויק. שינוי בינוני באותו זמן בכל יום. 3. יום 1-14: תוספת של גורמי גדילה יום 1: לשנות את המדיום על כל בארות (1 מ”ל לכל טוב) באמצעות RDM עם ההרכב פקטורי גדילה ליום 0 (ראה שלב 2.4). יום 2: לשנות את המדיום באמצעות RDM (1 מ”ל לכל טוב) עם 10 מ מ NIC, 5 ננוגרם למ”ל FGF-basic, הראש ng/mL 10, 10 ננוגרם למ”ל DKK-1 ו- 10 ננוגרם למ”ל IGF-1. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 100 µL של ה-NIC, 5 µL של FGF-basic, 1 µL של הראש, 1 µL של DKK1 µL 1 של IGF1 10 מ”ל של RDM. יום 4: לשנות את המדיום באמצעות RDM (1 מ”ל לכל טוב) עם 100 ננוגרם למ”ל activin A, 10 ננוגרם למ”ל DKK-1 ו- 10 ננוגרם למ”ל IGF-1. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 10 µL של activin A, 1 µL של DKK1 ו- µL 1 של IGF-1 ל- 10 מ”ל של RDM. הערה: שימו לב כי תאים הם confluent בשלב זה. יום 6: שינוי המדיום באמצעות RDM (1 מ”ל לכל טוב) עם 100 ננוגרם למ”ל activin A ו- 10 מיקרומטר סו 5402. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 10 µL של activin A ו 10 µL של סו 5402 10 מיליליטר RDM. ימים 8, 10 ו- 12: לשנות את המדיום באמצעות RDM (1 מ”ל לכל טוב) עם 100 ננוגרם למ”ל activin A, 10 מיקרומטר סו 5402 מיקרומטר 3 CHIR99021. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 10 µL של activin A, µL 10 של סו 5402 ו- 3 µL של CHIR99021 10 מ”ל של RDM. 4. יום של העשרה עד חלוף RPE 0 מעיל צלחת 6-ובכן בפקטור גדילה מופחת ECMH בהתאם להמלצות היצרן. מאפשרים להגדיר עבור 1 h בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס Aliquot את עוצמת הקול של DPBS צריך ו 1 מ”ל של RDM לכל טוב של העשרה וחמים באמבט מים כדי 37 ° C. הביאו TDE בטמפרטורת החדר וחמים הצורך באמצעי אחסון של RSM, ריאגנט מיקרוביאלית ו Y-27632 ל 37 מעלות צלזיוס. הוספת ריאגנט מיקרוביאלית, Y-27632 קבלת 0.5 x ו- 10 מיקרומטר בקומפוזיציות בהתאמה RSM. להשתמש בינוני במשך הימים הראשונים 4-7 כדי לשפר את הקובץ המצורף. וביופסיה בינוני בילה כל בארות ולהוסיף 1 מ”ל לכל טוב של RDM ומחוממת מראש (אין צורך גורמי גדילה). באמצעות מיקרוסקופ ויבתר, לנתח באופן ידני, לגרד משם כל התאים הלא-RPE באמצעות טיפ pipet P10. הערה: עיין בסעיף התוצאות נציג דוגמאות. לאחר ניתוח, תשאף RDM וסלולרי כל פסולת. תשטוף פעמיים עם 1 מ”ל של DPBS מראש ומחוממת לכל טוב. להוסיף 0.5 מיליליטר TDE לכל טוב של צלחת 12-ובכן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להשתמש במגרדת התא כדי להסיר בעדינות את התאים מהצלחת. השתמש pipet P1000 כדי בעדינות triturate התליה תא/TDE על-ידי pipetting למעלה ולמטה 3 – 4 פעמים כדי ליצור השעיה אחיד. לדלל התליה תא/TDE 1:10 ב RSM ומחוממת מראש, בלי Y-27632. צנטריפוגה תא ההשעיה-g x 173 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. תשאף האמצעי בגדר תא, resuspend התאים RSM עם 10 מיקרומטר Y-27632 (1 מ”ל לכל מועשר היטב). זן התאים באמצעות מסננת תא רשת ניילון עם 40 µm נקבוביות. לספור את מספר התאים באמצעי אחסון שצוין באמצעות hemocytometer ולחשב את הריכוז של תאים בהפתרון מאומצות. תאי זרע על הגורם צמיחה מופחתת צלחות מצופה ECM-עונה 1 פרק 10 5 תאים/cm 2 ב 4 מיליליטר RSM עם 10 מיקרומטר Y-27632. להחליף את RSM 10 מיקרומטר Y-27632 48 שעות לאחר זריעה תא ולהמשיך להחליף מדיה כל 3-4 ימים (למשל בימי שני וחמישי). לא יחליפו את 10 מיקרומטר Y-27632 לאחר 4-7 ימים- מאפשרים לתאים בוגרים 28 עד 35 ימים-CO 37 ° C ו- 5% 2. להמשיך להחליף את RSM כל 3-4 ימים (למשל בימי שני וחמישי). 5. ההבשלה: המעבר 1 ו- 2 RPE הערה: אמצעי אחסון מצוינים עבור 1 טוב של צלחת 6-ובכן או בקבוקון T75 כמצוין על-ידי סוגריים. בין יום 28 עד 35 מעבר 0, מעיל 6-ובכן צלחת (T75 הבקבוק) עם ECMH לפי המלצות היצרן. Aliquot עוצמת הקול של DPBS ו- RSM הדרושים וחם באמבט מים כדי 37 ° ג TDE להביא לטמפרטורת החדר. וביופסיה בילה בינונית בארות, לשטוף היטב פעמיים עם 2 מיליליטר (מ”ל) מראש ומחוממת DPBS. הערה: אין להשתמש 10 מיקרומטר Y-27632. DPBS תשאף ולהוסיף 1 מ”ל (5 מ ל) של TDE. מקום חממה ב CO של 37 ° C ו- 5%-2 למשך 5 דקות. לאחר דגירה, תצוגה תאים במיקרוסקופ הפוך כדי לאשר את התאים הם קבלנות וניתוק. בעדינות באמצעות המגרד של תאים בגודל מתאים, להסיר התאים לתחתית הבאר או הבקבוק. השתמש טיפ P1000 (10 מ”ל סרולוגית pipet) כדי בעדינות triturate התליה תא/TDE למעלה ולמטה 3 – 4 פעמים כדי ליצור השעיה אחיד. לדלל תא ההשעיה 1:10 ב RSM. להזמין 2 מ”ל (5 מ ל) של RSM כדי לשטוף את הבקבוק/היטב ולהוסיף התליה תא מדולל. הערה: אל תאפשר זמן החשיפה אנזים לחרוג מינימלית 25 Centrifuge התליה תא ב g x 173 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. האחות האמצעי בגדר תא, resuspend תאי 1 מ”ל (5 מ ל) של RSM זן התאים באמצעות מסננת תא רשת ניילון עם 40 µm נקבוביות. לספור את מספר התאים באמצעי אחסון שצוין באמצעות hemocytometer ולחשב את הריכוז של תאים בהפתרון מאומצות. זרע תאים על הלוחות מצופים ECMH-עונה 1 פרק 10 5 תאים/cm 2 ב 4 מ ל (15 מ ל) של RSM. לאפשר את התאים להבשיל במשך 30 יום. להמשיך לשנות את RSM כל 3-4 ימים. חוזר את ההליך הנ ל (שלב 5.2-5.11) ביום 30 כדי מעבר תאים מן המעבר 1-2- 6. יצירה של הבנק תא ביניים: הקפאה קריוגנית של המעבר 2 יום 3-5 RPE הערה: Cryopreserve תאים בזמן שהם נמצאים subconfluent (~ 50%) לא המלווה אותם פיגמנט. בהתבסס על מספר התאים, לחשב את עוצמת הקול של הקפאה קריוגנית בינוני עם 10% דימתיל סולפוקסיד צריך resuspend את התאים-ריכוז של 3 x 10 6 תאים למ”ל. השלבים הבאים 5.2 ל 5.8. Resuspend בגדר תא במדיום הקפאה קריוגנית עם 10% דימתיל סולפוקסיד 3 x 10 6 תאים/מ ל ולהעביר 1 מ”ל של התליה תא בקבוקונים קריוגני 1.2 מ ל. מניחים צלוחיות קריוגני במיכל ההקפאה שנועדה מגניב ב-1 ° C/דקה ומניחים ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להעביר חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך- הערה: תאים אלה יהיה מעבר 3 על מפשיר. התרבות התאים עוד 30 יום לפני אפיון. זרעים המעבר RPE 3-1.5 x 10 הוא 5 ס מ 2 על מפשיר. 2 , 4 , 6 , 7

Representative Results

שיטה זו גורמת לייצור טפט הומוגנית, פיגמנט, cuboidal של RPE. ציר הזמן באיור 1 מתאים לתמונות מתואר באיור2. כפי שמוצג באיור 2A, המושבות תאי גזע עמוסים באופן הדוק עם קצוות מוגדרים ותאים fibroblastic אין בין מושבות או תאים אטומים בתוך המושבות. איור 2B מספק ייצוג של ילדותי RPE כי הם subconfluent. אם התאים נמצאים confluent כבר בשלב זה, הם לא יכולים להאריך את תחזיות שחיוניים לתהליך הבידול. תאים שהם קשות subconfluent לא יהיו מסוגלים ליצור טפט ויוצרים צמתי צר, האופיינית של האפיתל. פרטים על איך לייעל את הנהרות מתוארים במקטע דיון. איור 2C מראה המורפולוגיה של שני הסוגים הנפוצים ביותר של הלא-RPE שעשויות להתעורר במהלך תהליך בידול זה: תיקוני עצבית או fibroblastic. חשוב לציין כי הטלאים עצבית להופיע אטומה במיוחד על מיקרוסקופ ויבתר, ואילו המדבקות מוגדרים, כמו fibroblastic שקופים כמעט על מיקרוסקופ ויבתר. זה יכול להיות מועיל לסמן אזורים אלה על צלחת תרביות רקמה בעט אתנול-הוכחה המעבדה לזהות אותם יותר בקלות על מתחם מיקרוסקופ אור והן ויבתר מיקרוסקופ. דמויות 2D-F מראים את גבולות בהיר אופייני, מורפולוגיה המרוצף, פיגמנטציה להצביע על תרבות בריא, התבגרות של RPE. איור 3 היא תמונה הגדלה גבוהה יותר להראות את מראה שונה RPE לבגרות מלאה מתואר על ידי ניגודיות שלב מיקרוסקופיית שדה בהיר. -מעבר לשלושה ימים 30, התאים מוכנים האפיון שכבר תואר בפרסומים קודמים, כולל ביטוי RNA, ביטוי חלבון, הפרשת גורם הגדילה של phagocytosis2,4,6 ,7. אפיוני אלה מראים כי התאים ייצג את התמונות האלה הן לא רק פיגמנט וגם cuboidal, אבל phagocytic, שלאחר mitotic, ו מקוטב. איור 1:. ציר זמן עבור התוספת של גורמי גדילה, התבגרות של RPE- גורמי גדילה יתווספו 12-ובכן צלחות מיום 0-14. התבגרות RPE מתורבתים. ובכן 6 צלחות או מבחנות T75 מיום העשרה עד 30 ימים לאחר הפשרה (מעבר לשלושה ימים 30). חיצים מציינים אנזימטי תא passaging. (A-E) להלן צירי הזמן להתאים התמונות באיור2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: זרימה של התבגרות RPE ומורפולוגיה נציג. תאי גזע pluripotent המושרה מיד לפני passaging על בידול (א). לא בוגר subconfluent תאי RPE-יום 2 (B) ולפני פיק-כדי-הסר העשרה ביום 14; תיקונים שאינם-RPE (המסומנים על ידי חצים לבנים) מופיעים כתמים או אטום “סרטים” (C). RPE-המעבר 0, 1 ו- 3 ביום 30 (D, E, ו- F). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: בוגר RPE-מעבר 3: 30 יום מורפולוגיה cuboidal מתואר לעומת שלב (A), פיגמנטציה מתואר בהיר-שדה (B). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע pluripotent. השיטה הייתה אופטימיזציה באמצעות שני האדם עובריים ו המושרה גזע pluripotent מכל שיטה ללא מזין, סרום ללא תרבות. מאז הבידוד הראשונית של תאי גזע עובריים בשנת 1998 ההטיה של תאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) ב- 2007, שפע של התרבות תאי גזע שיטות כבר פיתח14,15,16, 17. שיטות אלה אמורה להספיק לייצור תאי גזע המושבות כי הם רגישים שונות זו. ישנם ללא המגבלות המוכרות את הישימות של שיטה זו לתאי גזע pluripotent נגזר ומתוחזק כראוי.

השלבים הקריטיים ביותר הם passaging של תאי גזע ליום 0 של בידול (שלב 2.5) והצורך פוטנציאליים לנתיחה ידנית ביום 14 של התהליך (שלב 4.5). כאשר בוחרים כדי להסיר תאים מן המושבות תאי גזע, עיין התמונות בקנט18. כמצוין, התאים fibroblastic בין מושבות תאים אטומים בתוך המושבות לציין תאים זה צורך להסיר לפני תחילת פרוטוקול זה18. צריך להיות passaged מושבות מובחן, אציקלוביר רק עם קצוות מוגדרים עבור בידול.

מספר תאי גזע נזרע לכל טוב (שלב 2.6.7), זה מורכב על ידי העובדה כי תאי גזע לא יכול להיות triturated להשעיה תא בודד על המעבר לא במדויק ולעמוד על שימוש של hemocytometer. קירוב של תאי גזע confluent 80% הוא הצביע עבור 1 passaging טוב של צלחת 6-ובכן לתוך בארות 4 של צלחת 12-. טוב. ההבדלים בין שורות תאי הגזע, כגון קצב צמיחה, יכול להשפיע על מה מהר ילדותי RPE להגיע למפגש בין 0 עד 4 ימים. תאי גזע יפיקו RPE בין הנהרות מדויק, אבל התשואה תא יושפעו באופן שלילי אם התאים נמצאים דליל מדי בשלב זה. תאי RPE ילדותי צריך להיות כ- 40-50% confluent על יום 1, כמעט 100% confluent על ידי יום 4. אם התאים לא מייצרים טפט confluent ביום 4 או 6, הפרוטוקול יש לחזור על צפיפות גבוהה יותר זריעה ביום 0. לדוגמה, אם 1 טוב של צלחת 6-ובכן היה passaged ל 4 בארות של צלחת 12-ובכן ביום 0 ילדותי RPE אינם 100% confluent-יום ד’, להפחית את seeding כדי קטע 1:3 או 1:2 ביום 0 או לאפשר את תאי הגזע להיות יותר confluent לפני passaging. חיוני להקים צפיפות זריעה עקבית בעת השוואה בין שורות תאים מרובים.

השלב חיתוך ידני ביום 14 נחוץ רק כאשר תאי RPE שאינם קיימים בתרבות (איור 2C). מאז התוספת של CHIR99021 לפרוטוקול, שורות רבות של תאי גזע pluripotent דורשים הקטן לנתיחה ידנית ללא. כמה הכנות יש שכיחות גבוהה יותר של מדבקות עצבית וזה קריטי כדי להסיר תאים אלה. אם RPE אינם קיימא-מעבר 0 דרך המעבר 3, זה אפשרי לחזור על פרוטוקול בידול לוקח זמן מספיק כדי להסיר את כל התאים הלא-RPE. זה לא קורה לעתים קרובות, אבל זה הזכיר כאן לציין כי הצעד לנתיחה ביום 14 ניתן למטב בעת הצורך.

ישנם מגוון של פרוטוקולים של בידול RPE נבדלים עלות, כמו גם שיטות, יעילות, כימות, הערכה תפקודית, שהאחרון שבהם היה נבדקו ביסודיות2. אנו מעדיפים את השיטה 14 יום מפורט כאן בגלל היעילות שלה, הסתגלות, ישימות למגוון רחב של התא קווים4,7,8. הצעד הקפאה קריוגנית פרוטוקול זה מספק גם יתרון גדול ביצירת של הבנק תא ביניים לשימוש עתידי, הימנעות ולשונות רבות-אל-הרבה בניסויים. החל מ- 4 בארות של צלחת 12-. ובכן, זה אפשרי להרחיב לתוך צלחות 6-ובכן-המעבר 0, מבחנות T75-קטע 1 ו- 2. -מעבר 2 יום 3-5, כאשר התאים עדיין subconfluent, לא המלווה אותם פיגמנט, זה אפשרי cryopreserve עשרות מיליוני תאים ולאחר מכן להפשיר את RPE בוגרת, איזור המעבר 3 יום 30, כדי לבדוק ביטוי RNA, ביטוי חלבונים, גורם גידול הפרשת, phagocytosis, וכו ‘. הקמנו גם פרוטוקולים להרחיב RPE עבור עד 13 קטעים 19.

. מצפה בקוצר רוח, שיטה זו יהיה שימושי עבור iPSC מידול של מחלה עינית, דור של RPE לתרפיה תאית. לגבי מידול המחלה iPSC, פרוטוקול זה כיום משמש במעבדה כדי לייצר RPE משורות CRISPR-מתוקן עם פקדים שאינם תוקנו מן המטופל באותו. יתר על כן, הפרוטוקול לסגלה סובסטרטים סינתטי ועל תנאים נטול קסנו שימושיים עבור שמירה על שיטות הייצור טוב נדרש טיפול הסלולר.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה ביוזמת גרלנד חזון, מכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית (CIRM; מענקים DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616, TG2-01151), קרן קהילתית ורמונט, קרן בארס, ו קרן הלחימה עיוורון וויין-Gund המחקר Translational האצת התוכנית.

Materials

SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet Baker model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 6' Baker laminar flow biosafety cabinet
Dissection Hood Labconco Model 3970405 laminar flow bench top
dissecting microscope Nikon SMZ 1500 heated stage
air-jacketed CO2 incubator Sanyo MCO-17AIC 37 oC and 5% CO2
inverted phase contrast microscope Olympus IX53
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
DMEM/F12 Gibco 10565042
N2 Supplement Gibco 17502048
B27 Supplement Gibco 17504044
NEAA Gibco 11140050
Name Company Catalog Number Comments
Growth Factors and Reagents
Nicotinamide Sigma N0636
Recombinant mouse noggin R&D systems 1967-NG-025
Recombinant human DKK-1 R&D systems 5439-DK-010
Recombinant IGF-1 R&D systems 291-G1-200
FGF-basic Peprotech 100-18B
Recombinant human/mouse/rat Activin A Peprotech 120-14E
SU5402 FGF inhibitor Santa Cruz Biotechnology sc-204308
Name Company Catalog Number Comments
Substrates
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free Corning 356237 extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free Corning 354277 growth factor reduced ECMH
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
1X Versene (EDTA) Gibco 15040066
DPBS Gibco 14190250
1X PBS (no calcium, no magnesium) Gibco 10010023
TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) Gibco 12563011
X-VIVO 10 (RPE supporting medium) Lonza BW04-743Q
Y-27632 Tocris 12-541-0 (1254)
CryoStor CS10 BioLife Solutions 210102 cryopreservation medium
1.2 mL Cryogenic Vial Corning 430487
Mr. Frosty (freezing container) Nalgene 5100-0001 freezing container
Normocin Invivogen ant-nr-2 antimicrobial reagent
Name Company Catalog Number Comments
Other Equipment
Pipet-aid Drummond 4-000-101
12-well culture plate Corning CLS3516 Used during differentiation.
T75 flask Corning 430641 Used during RPE maturation.
6-well culture plate Corning CLS3513 Used during RPE maturation.
cell scraper Corning 08-771-1A Used during passages.
cell strainer Falcon 352340 Used during passages before cell count.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
  3. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).
  4. Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).
  5. Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration. Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).
  6. Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).
  7. Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate. Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).
  8. Leach, L. L., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).
  9. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  10. Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).
  11. Choudhary, P., et al. Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage. Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).
  12. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).
  13. Lane, A., et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).
  18. Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
  19. Croze, R. H., et al. ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium. Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).

Tags

Retinal Pigment Epithelial CellsHuman Embryonic Stem CellsInduced Pluripotent Stem CellsRetinal DifferentiationDirected DifferentiationStem Cell BiologyEye ResearchRPERetinal DevelopmentStem Cell Disease ModelGrowth FactorsSmall MoleculesExtracellular MatrixHydrogelEDTACell PassagingCell RemovalUndifferentiated Stem CellsEfficiencyEnrichment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (128), e56274, doi:10.3791/56274 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image