Tillämpning av Laser mikro-bestrålning för undersökning av singel och dubbel Strand paus reparation i däggdjursceller

1. cellkultur och generering av stabil celler växa CHO-K1 celler i väsentliga minimalmedium kompletteras med 10% fetalt bovint serum. Upprätthålla celler i en fuktad inkubator med 5% CO 2 vid 37 ° C. Transfect CHO-K1 celler med 1 µg av plasmid DNA som innehåller mänskliga XRCC1 med en C-terminal grönt fluorescerande protein (GFP) taggen med hjälp av en kommersiell transfection reagens efter tillverkaren ' anvisningar. Välj CHO-K1 celler stabilt uttrycker de mänskliga XRCC1-GFP fusion använder 800 µg/mL geneticin och berika XRCC1-GFP uttrycker befolkningen som använder fluorescens assisterad cell sortering (FACS). Platta celler vara mikro-bestrålade i odlingskärl med täckglas bottnar, så att de når ungefär 75% eller större konfluens följande dag. Vissa utrymmen mellan celler är önskvärd, särskilt om du använder registrering för att återvända till samma bildfältet (beskrivs i avsnitt 3.2). 2. Mikroskopet set-up Välj en laserskanning confocal Mikroskop utrustat med lämplig laser och optik och styrprogram för mikro-bestrålning/photostimulation. Presenterade experiment använder en laser skanning confocal Mikroskop som har ändrats för att inkludera en 355 nm laser, fiber-kopplat till en galvanometer ljusaktivering miniscanner och styras via tillverkaren ' s kontroll och analys programvara. Detta system kan utföra mikro-bestrålning i en användare-utsedd region av intresse (ROI) med hjälp av ljusaktivering miniscanner (355 nm laser) eller standard confocal galvanometer (405 nm laser). Välj våglängden som ska användas för mikro-bestrålning, att säkerställa att alla optiska komponenter i den mikro-bestrålning lightpath är lämpliga för den valda våglängden. Obs: Presenterade systemet använder en 40 × C-Apochromat (numeriska bländaröppningen (NA) 1.2) oljeimmersionsobjektivet tillsammans med en UV filter kub för 355 nm mikro-bestrålning och en 20 × C-Apochromat (NA 0,75) torr mål med hjälp av standard confocal lightpath för 405 nm mikro-bestrålning. Syftet för 20 × som används i konfigurationen är inte kompatibel med 355 nm våglängd; Därför använde vi den 40 × för 355 nm endast. Med målsättningen torr för skada kan immunofluorescens protokoll tillämpas nedströms utan rengöring av nedsänkning olja, vilket är varför vi utnyttja detta mål när det är möjligt. Konfigurera mikroskopet för mikro-bestrålning experimentet. För att behålla överensstämmelsen mellan experiment, utse en standardiserad konfiguration av mikroskopet komponenter som ska användas för varje typ av mikro-bestrålning. Spara inställningarna som en förinställning mikroskopet ' s operativsystem, om möjligt. Obs: I systemet presenteras celler är mikro-bestrålade och avbildas med enkelriktad skanning, en skanningsupplösning på 1024 x 1024 pixlar med 1 x scan zoom, vid en bildhastighet 8 bildrutor per sekund (fps), och med pinhole ange ungefärligt 4 luftiga enheter (AU), som bestäms för 488 nm laser (69 µm). Inställningen öppna pinhole valdes för att maximera mängden ljus som fångas i varje bild, medger användning av lägre imaging laser befogenheter och minska fotoblekning. 3. Laser mikro-bestrålning plats det beredda kultur maträtt, som innehåller celler av intresse, på Mikroskop scenen och snäpper ordentligt. Om tillgängligt, placera kamrar bild i en scen-top inkubator och upprätthålla vid 37 ° C med 5% CO 2 under skada induktion. Detta steg är viktigast för live-cell timelapse imaging eller imaging långa sessioner. Annars plats celler på mikroskopet arrangerar och utför bestrålning vid rumstemperatur (~ 25 ˚C), och sedan snabbt återvända celler till en inkubator vid 37 ° C med 5% CO 2. Registrera bildfält att forskaren återvända till samma plats efter utför fixering, färgning eller andra förfaranden. Utföra registrering av skadade fält med hjälp av en kodad, automatiserad Mikroskop scenen eller cell kultur täckglas fartyg med en etsad eller märkt rutnät av XY platser. Om använder programvara bildregistrering, Välj en igenkännlig funktionen kultur fartygets (dvs, hörnet av täckglas eller barriär mellan brunnar), samla in en bild och registrera platsen för XY. Detta kommer att möjliggöra justering och registrering av XY platser markerade fält efter provberedning. Om du använder manuell registrering, registrera rutnät eller etsade platser för varje fält manuellt, var noga med att registrera orientering och placering av skålen på scenen. Om inga identifieringsfunktioner för cell kultur fartygen finns, identifiera skadade fält genom okulärbesiktning av cellmorfologi och densitet. Var noga med för att välja fält med tillräckligt distinkta funktioner vara igenkännligt under senare imaging. Obs: Detta kan vara tidskrävande att utföra om inte orientering och området kultur fartygets tätt. Välj ett fält för mikro-bestrålning och fokusera exemplet. För celler uttrycker fluorescently märkta proteiner, Välj fokalplanet med maximal nukleära tvärsnitt i fluorescerande kanalen av intresse. För celler inte uttrycker märkt proteiner, eller för dem utan tydlig cellkärnelokalisering, faskontrast eller differentiell störningar kontrast (DIC) imaging kan användas att hitta rätt fokalplanet. ​ Obs: en praktisk funktion i faskontrast och DIC imaging är det faktum att fokalplanet flyttar genom provet, samma funktion kan visas när ljus eller mörk beroende på det relativa fokalplanet. Välj en tydlig funktion inom kärnan, såsom en nucleolus, och flytta fokalplanet upp och ner medan du observerar denna förändring i utseende. Sanna fokalplanet kommer att ligga inom övergången från ljus till mörk. För att fokusera exemplet, Välj fokalplanet där funktionen markerade har den skarpaste kontrasten. Registrera placeringen av fältet av intresse. Skapa en 3 x 3 pixlar kvadrat ROI inom Mikroskop mjukvaran, placera denna ROI över kärnan i en cell skadas och ange detta ROI vara skadan ROI. Samla en före skada bild, inklusive placeringen av skadan ROI. För experiment som inte använder fluorescerande proteiner, förvärva en faskontrast eller differential störningar kontrast (DIC) brightfield bild att identifiera och registrera kärnor för skador. För live-cell experiment med hjälp av fluorescerande proteiner, förvärva en bild som innehåller brightfield och kanalen fluorescens för proteinet av intresse (dvs. laser linje 488 nm för excitation av GFP, laser linje 561 nm för excitation av RFP). I experiment med hjälp av CHO-K1 XRCC1-GFP, fluorescens upphetsad av 488 nm laserlinjen samlades samtidigt med kanalen brightfield överförda DIC. Initiera laser skador. i systemet presenteras kontroll laser dosen av den totala tiden tillbringade skanning skadan ROI. Eftersom galvanometer för 355 nm laser fungerar på en fast samplingshastighet, laser dosen styrs av den tid som tillbringas vid upprepade tillfällen scanning valda skadan ROI: i data presenteras här, mikro-bestrålning på 355 nm utförs i 2 och 10 sekunder. Däremot styr 405 nm laser dosen genom att modulera sökhastighet och utföra en genomsökning av den valda skadan ROI. I data pharmades här, använda 8 och 0,5 fps för mikro-bestrålning vid 405 nm. En avsökningshastighet av 8 fps ger en lägre laser dos än 0,5 fps, eftersom lasern spenderar mindre tid på varje pixel under genomsökningen. Båda lasrar drivs på 100% effekt. Se avsnitt 3.7 instruktioner på att mäta lasereffekt direkt. Obs: Varje enskild Mikroskop system kan skilja sig i hur laser power levereras till en utsedda ROI, liknar hur 355 nm och 405 nm skiljer sig i systemet presenteras. Användare kommer att behöva fastställa proceduren för deras Mikroskop system och rapportera dessa parametrar inom deras metoder sektioner. För levande cell imaging, utföra timelapse bild förvärv av brightfield och fluorescens kanaler. Justera varaktighet och frekvens av timelapse att optimera datainsamling, helst fånga ansamling av fluorescerande proteinet på skadan ROI och dess dissociation över tidsförloppet för experimentet. Experiment med XRCC1-GFP samlat bilder varje 30 sekunder i 20 minuter. ​ Obs: frekvensen av timelapse bildtagning kan begränsas av fotoblekning av fluorophore, komplicerande analys av ackumulering och dissociation. Fotoblekning kan utvärderas genom att observera oskadade celler under timelapse och justera förvärv villkor att minimera fluorescerande signalförlust i dessa oskadade celler. Vissa fotoblekning kan vara oundvikliga, så användare kan kompensera för signalförlust genom att normalisera de fluorescerande stödnivåerna skadade celler med oskadade celler i varje bildruta i en timelapse. Efter tid kursen är klar, Välj ett nytt fält av celler för skador eller åtgärda skadade celler för vidare analys, som beskrivs i avsnitt 4. Fortsätt mikro-bestrålning och timelapse imaging tills önskat antal skadade celler nås. ​ Obs: Vi rekommenderar skadar sammanlagt 10-25 celler per valda villkoret för att bedöma cell till cell heterogenitet som svar på de inducerade skador. Även om de flesta confocal system vilja tillåta förbrukaren till skada mer än en cell under varje mikro-bestrålningen, introducerar detta vacklade skada inledande gånger, vilket kan komplicera analysen av peak rekrytering tid över ett stort antal celler eller dissociation tid för snabba händelser. I vissa system, kan samtidiga skador induktion över flera ROIs minska laser dosen tas emot av varje oberoende ROI. Därför, om inte dessa timing/effekt-frågor behandlas direkt av användaren, rekommenderas det att cellerna skadas individuellt. För analys av immunofluorescens (om), utföra skador och antingen åtgärda omedelbart celler, som beskrivs i avsnitt 4, eller tillåta celler för att reparera för valda steg om tid (dvs. 1, 5, 10 eller 20 min). Efter önskad tid förflyter, fixa och färga cellerna, som beskrivs i avsnitt 4. Att öka totala antalet celler för om analys, skada ytterligare fält inom kultur fartyget att generera en flera fält tidsförloppet för svaret efter skada. Spela in XY platsen för varje fält och den tidpunkt då skadan uppstod. Efter den önska totalen reparera tid förflyter, fixa och färga cellerna som beskrivs nedan. Efter observation av protein rekrytering vid valda doser, åtgärd och rapport laser power nivåer efter fiber och efter målet att noggrant karakterisera och rapportera laser doser. Vi använder en kompakt digital kraftmätare och två olika fotodioden sensor huvuden; en kopplad direkt till laser fiber att mäta efter fiber utgång, och den andra placeras på Mikroskop scenen för att mäta post-objective utdata. Att mäta lasereffekt, Placera sensorn i önskad konfiguration (efter fiber eller post-objective) och utföra mikro-bestrålning som beskrivs ovan, under de mätningar som görs av wattmetern. Vara medveten om att samplingsfrekvensen för på wattmetern inte kanske är tillräckligt snabb för att fånga mycket snabb mikro-bestrålning evenemang, så det kan vara nödvändigt att köra flera iterationer av experimentet att säkerställa att wattmetern korrekt detekterar den applicerade dosen. Obs: För 355 nm laser, Vi mätte en genomsnittlig maximal effekt av ca 5 mW efter fiber och cirka 19 µW efter mål. 405 nm laser, mikro-bestrålning utfördes i slingor av 30 iterationer för att övervinna 0,01 s maximal samplingsfrekvens för wattmetern och genomsnittliga peak befogenheter 1,5 mW och 2.4 mW mättes med scan hastigheter på 8 och 0,5 bildrutor per sekund , respektive. Varje wattmeterns är olika. Användare kommer att behöva fastställa operativa våglängder och samplingsfrekvenser för deras individuella kraftmätare. 4. Immunofluorescens färgning förfaranden analysera strand paus induktion av om färgning. Fix celler med 3,7% formaldehyd (försiktighet) fosfat buffrad saltlösning (PBS) för 10 min. Aspirera formaldehydlösning och tvätta 3 gånger med PBS. Protokollet kan stoppas här genom att placera PBS tillbaka på cellerna, och cellerna kan förvaras vid 4 ° c i upp till 1 vecka. FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd är giftigt och cancerframkallande. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kassera det giftiga ämnet enligt instruktioner från institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden. Permeabilize celler med 0,25% Triton x-100 i PBS under 10 minuter vid rumstemperatur (RT) och sedan tvätta 3 gånger med PBS. Blockera icke-specifik antikropp bindande genom ruvning i 30 min i PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA) på RT. Inkubera med primära monoclonal antibody mot γH2AX och primära polyklonala antikroppar mot 53BP-1 både utspädning 1: 750 i PBS med 1% BSA för 1 h på RT och tvätta sedan 3 gånger med PBS. Inkubera cellerna med Alexa 488 get antimus och Alexa 546 get anti-kanin både utspädning 1: 2000 i PBS med 1% BSA för 1 h på RT och tvätta sedan 3 gånger med PBS. Stain nuclear DNA med en 10 mg/mL lösning av DAPI (4 ', 6-diamidin-2-fenylindol, försiktighet) utspätt till 1: 5000 i PBS för 5 min, eller använda jämförbara nukleära färgämne, och sedan tvätta 3 gånger med PBS. Varning: DAPI är giftiga och mutagena. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kasta det giftiga ämnet enligt uppdrag av institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden. Plats PBS eller PBS + 0,1% natriumazid (försiktighet) tillbaka till de färgade cellerna. Protokollet kan stoppas här och celler lagras vid 4 ° c i flera dagar, eller gå vidare till bild förvärvandet i avsnitt 5. ​ Försiktighet: Natriumazid är giftiga. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kasta de giftiga ämnena enligt uppdrag av institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden. Analysera induktion av bas lesioner eller DNA addukter av om färgning. Fix och permeabilize celler i iskall metanol (försiktighet) för 20 min vid -20 ° C. Varning: Metanol är giftiga och brandfarliga. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kasta det giftiga ämnet enligt uppdrag av institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden. Aspirera på migthanol och låta provet torka helt i 15 min. protokoll kan stoppas här och celler lagras vid-20 ° c torr i upp till 3 dagar. Rehydrera cellerna i PBS för 15 min. Denature DNA med 2 N HCl (försiktighet) för 45 min på RT och tvätta 3 gånger med PBS. FÖRSIKTIGHET: HCl är frätande. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kasta det frätande ämnet enligt uppdrag av institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden. Neutralisera i 50 mM Tris-HCl pH 8,8 för 5 min följt av 3 tvättar med PBS. Inkubera cellerna i blockerande buffert gjort med 5% normala get serum och 0,1% Triton x-100 i PBS för 1 h på RT. Inkubera med primära antikroppar för 8-oxo-2´-deoxyguanosine (8-oxodG, 1: 400) eller cyclobutane pyrimidin dimer (CPD, 1:1, 000) i get serum blockerande buffert för 1 h på RT och sedan tvätta 3 gånger med PBS. Inkubera cellerna med Alexa 488 get antimus i förhållandet 1: 2000 i get serum blockerande buffert för 1 h på RT och tvätta 3 gånger med PBS. Stain nuclear DNA använder 1: 5000 DAPI (10 mg/mL) i PBS för 5 min och tvätta 3 gånger med PBS. Om använder kamrar täckglas, placera PBS eller PBS + 0,1% natriumazid tillbaka på de färgade cellerna. Protokollet kan stoppas här och celler lagras vid 4 ° c i flera dagar, eller gå vidare till bild förvärvandet i avsnitt 5. Montera alternativt celler i rekommenderad monteringsmedium, om en ytterligare täckglas kan placeras ovanpå kultur fartyget. En gång botade, monterade celler kan förvaras vid 4 ° c för långa tidsperioder. 5. Bild förvärv för immunofluorescens experiment rengör botten täckglas av kultur fartyget med etanol och placera den tillbaka på confocal Mikroskop scenen. Säkerställa att orientering och position fartyg på scenen motsvarar orientering och position registreras när skada förmåddes. Säkra kultur fartyget för att säkerställa optimal registrering och imaging. Hitta tidigare avbildade fält med hjälp av registrering teknik valts (beskrivs i 3.2). För manuell registrering med ett täckglas med ett etsat rutnät, föra rutnätet i fokus och hitta identifiera märken. Sedan använda inspelade XY-koordinater att hitta skadade celler. För image-baserad automatiserad registrering, leta upp funktionen strukturella används som referens i steg 3.2.1 och sedan justera den aktuella levande mikroskop vyn så nära att den inspelade bilden som möjligt. När justerade, mäta den nuvarande XY Mikroskop scen läge och jämföra det med XY läge referensbilden. Det linjära avståndet mellan de två platserna definierar de X- och Y-förskjutningen. Gäller denna förskjutning för varje inspelade XY läge att identifiera bilden eller de fält som innehåller bestrålade cellen. Offset funktionen kan vara automatiserad i Mikroskop kontroll mjukvaran eller utförs manuellt. Om inga lämpliga anmälningscentral kunde identifieras, manuellt leta upp celler genom att skanna bilden och att hitta funktionerna som tidigare identifierade cell. Hämta bilder med lämpliga Mikroskop inställningar för att samla alla färgade mål, inklusive en brightfield bild (inställning i avsnitt 2.3 och fokus i avsnitt 3.3). I presenteras experiment, flerkanaliga bilder samlades in med hjälp av följande excitation laserlinjerna och fluorophores: 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 och överförda DIC brightfield) och 561 nm (Alexa 546). Alla lasrar passera genom ett enda acousto-optisk avstämbara filter styr överföringen av både laser våglängd och makt. 6. Levande cellen bildanalys av rekrytering av fluorescerande proteiner till mikro-bestrålade webbplatser Öppna förvärvade bilder i ansökan bild analys (NIS element eller ImageJ). Om nödvändigt, kombinera före bestrålning bilden med timelapse bilder att generera en enda bildsekvens av före och efter skadan induktion. Användare kan visa rekrytering genom att mäta förändringar i fluorescerande intensitet över det bestrålade området i förhållande till fluorescensintensiteten mätt över hela kärnan (se representativa resultat figur 1 B. ). För varje cell som ska mätas, först skapa en referens ROI som representerar kärnan. Använder en algoritm för tröskelvärde på fluorescerande signalen som innehåller bildpunkter som utgör kärnan och sedan omvandla detta område till en ROI. Vid behov kan ROI dras manuellt i med brightfield som referens. Justera ROI över tid kursen att säkerställa det nukleära området bevakas noggrant av ROI och rapportera genomsnittlig fluorescensintensiteten hos fluorescerande signalen inom denna ROI för varje bildruta. För varje cell mätas skapar en 6 x 6-pixel ROI och placera den över skador ROI för varje bildruta i tidsförloppet. Denna större ROI är nu skadan ROI för analys. Rapport menar ROI fluorescensintensiteten för varje bildruta. Obs: De flesta kommersiella bild analys programvara innehåller moduler för 2D objektföljning, och det finns ett antal Användarutvecklade makron för ImageJ eller FIJI som underlättar snabbare arbetsflöde och högre genomströmning (se https://imagej.nih.gov/ij/plugins/). Normalisera betyder skada ROI fluorescensintensiteten som för en motsvarande referens ROI i varje bildruta i en timelapse. Här menar nukleära fluorescensintensiteten används som referens ROI (se representativa resultat figur 1). normalisering kan utföras genom att subtrahera den genomsnittliga referensen ROI fluorescensintensiteten från medelvärdet skada ROI fluorescensintensiteten eller genom att dividera medelvärdet skada ROI fluorescensintensitet med den genomsnittliga hänvisningen ROI fluorescensintensiteten. Obs: Normalisering av division kan ge oförutsägbara resultat, om de används i situationer med mycket låg intensitet referensvärden. Upprepa för alla skadade celler, liksom för minst två kontroll, oskadade celler. Kontrollresultat cell kan användas för ytterligare normalisering, om så krävs. Grafen normaliseras intensitetsvärden över tiden att visa ändringar i rekrytering dynamics som en funktion av experimentell behandling. 7. Bildanalys av protein rekrytering påvisas med immunofluorescens öppen före och efter skadan bilder i ansökan bild analys. Före skadan bilderna innehåller skadan ROI(s) används för mikro-bestrålning. Kopiera ROI(s) och klistra in de efter skada bilderna att identifiera riktade celler. Generera en 6 x 6 pixel ROI för analys av protein rekrytering och placera detta ROI på platsen för skadan ROI. Denna större ROI är nu skadan ROI för analys. Rapportera den genomsnittliga skadan ROI fluorescensintensiteten. Normalisera betyder skada ROI fluorescensintensiteten som för en motsvarande referens ROI. Här menar nukleära fluorescensintensiteten hos den skadada cellen används som referens ROI (se representativa resultat figur 1). Generera hänvisningen ROI med hjälp av en algoritm för tröskelvärde på DAPI signalen för att definiera kärnan, och sedan konvertera detta område till en ROI. Rapportera den genomsnittliga referensen ROI fluorescensintensiteten. Normalisering kan utföras genom att subtrahera genomsnittlig referensen ROI fluorescensintensiteten från genomsnittliga skadan ROI fluorescensintensiteten, eller genom att dividera medelvärdet skadan ROI fluorescensintensiteten av genomsnittlig hänvisningen ROI fluorescensintensiteten. Obs: Normalisering av division kan ge oförutsägbara resultat, om de används i situationer med mycket låg intensitet referensvärden. Upprepa för alla skadade celler och utföra samma analys på minst två kontroll celler, enligt ovan. Grafen normaliseras intensitetsvärdena för varje uppmätt mikro-bestrålning händelse mot tiden för att visa ändringar i protein rekrytering eller typ av DNA-skador som en funktion av experimentell behandling.