JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Recherche en cancérologie

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Published: September 05, 2017
doi:
10.3791/56265
, ,
1Department of Oncologic Sciences,University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

Summary

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Abstract

Son derece koordineli DNA onarım yolları tespit etmek, tüketim ve hasarlı DNA üsleri yerine ve DNA kırılmalara tamiri koordine adlı biri yok. Moleküler Biyoloji teknikleri yapısı, enzimatik işlevleri ve Kinetik onarım proteinlerin açıklık var iken, hala nasıl onarım çekirdeği içinde koordineli olduğunu anlamak için bir gerek yoktur. Lazer mikro-ile DNA hasar inducing ve onarım protein alımı izleme için güçlü bir araç sunar. İndüksiyon DNA hasar tarafından lazer mikro-ile dalga boylarında bir dizi ortaya çıkabilir ve kullanıcıların güvenilir tek kırılmalara, temel lezyonlar ve çift doz aralığı ile kırılmalara neden olabilir. Burada, lazer mikro-ile tek ve iki ortak confocal lazer dalgaboyu 355 tarafından indüklenen çift kırılmalara tamir incelemek için kullanılır nm ve 405 nm. Belirli hasar karışımları inducing için uygulanan lazer doz daha fazla, doğru karakterizasyonu açıklanan, kullanıcılar tekrarlanarak lazer mikro-ışınlama veri toplama ve analizi gerçekleştirebilirsiniz.

Introduction

Floresan mikroskopi hücresel mimarisi görselleştirmek, protein yerelleştirme incelemek ve protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri izlemek için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan mikroskopi küresel DNA ajanlar, ultraviyole (UV) ışık gibi zarar uygulamadan sonra DNA hasarı yanıt çalışmaya iyonizan radyasyon, kimyasal oksitleyici veya etmen ajanlar, ve/veya chemotherapeutics sağlanan kullanarak yeni fikir başlatma, sinyal ve DNA alımı proteinler DNA hasar1,2sitelere onarabilirsiniz. Ancak, bu genel ve zaman uyumsuz olaylar zarar, işe alım emri, dernek veya ayrılma Kinetik hakkında ayrıntılı bilgi verirseniz sınırlı hale gelir ve anahtar DNA onarım proteinler arasındaki ilişkileri aranır. Neyse ki, lazer confocal mikroskoplar tarama gelişmeler, hasar inducing lazer dalga boyu ve floresan proteinler gelişmeler son 25 yılda daha geniş kullanılabilirlik olması koşuluyla araştırmacılar gelişmiş araçlar ile bunlar incelenmesi için DNA yönleri, hedeflenen DNA hasarı indüksiyon onarın.

Işınlama lazer microbeams hücresel ve hücre altı işlevleri çalışma için içeren hücrelerin hücre ve radyasyon Biyoloji3köklü bir araçtır. DNA onarım çalışması için bu teknik uygulama ortaya Cremer ve ortak çalışanlar son derece odaklanmış UV kullanıldığında (257 nm) 0.5 µm Çin hamster Over (CHO) nokta üzerinde DNA hasar ikna etmek için lazer microbeam sistemi hücreleri4 ve indüksiyon kurulan Bu sistem5DNA photolesions. Önemli gelişmeler UV microbeam yöntemleri üzerinde zaman, bu kabulü sisteme zarar sunan kendi özel kurulum ve oluşturmak için onun yetersizlik nedeniyle sınırlı iken (DSBs)6Kişilik strand tatili. Sonraki çeşitli UV-B (290 320 nm) ve UV incelenmesi-UV photoproducts, oksidatif lezyonlar, temel (320-400 nm) dalga boyu grup sayısı tarafından ortaya tek iplikçik keser (SSBs) ve DSBs indüklenen bağlı olarak lazer dalga boyu ve güç4,7,8,9,10 ( 3gözden geçirme) uygulanır. Ama güç için gereken daha fazla, bu UV-B ve UV-A dalga boylarında ajanlar, psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) ve Höchst boya, gibi duyarlılığı ile kombinasyonları da DNA hasar dalga boyu, güç ve maruz kalma süresi üzerinde bağımlı ikna etmek için bulunmuştur Neden hasar genellikle bu ajanlar11,12,13,14,15huzurunda indirdi. Bu yöntemlerin daha geniş kabulü için ele alınması gerekiyor hala teknik engel olmamasına rağmen bu gelişmeler mikro-ışınlama, kullanımı genişletilmiş.

Cremer ve iş önemli ölçüde tam olarak hücredeki son derece lokalize bir alana önemli zarar verici enerji uygulamak için UV microbeam odaklanarak mikro-radyoterapi alan gelişmiş. Gelişmiş confocal mikroskoplar ve lazer mikrodiseksiyon sistemleri gibi sıkıca odaklanmış ışık daha geniş erişilebilir; Ancak, UV kaynakları kapsamları için kaplin ve onlar hala indüklenen renk sapmalarını ile ilgili çoğu kullanıcılar3,6,16önemli zorluklar sundu. UV boya popülerlik 1990’larda, boyunca optik odaklanan yetenekli arttı ve yakalama UV-heyecanlı Floresans daha yaygın olarak kullanılan16oldu ve lazer tarama gelişmeler kullanıcılarına son derece oluşturma yeteneği UV odaklı hücreleri6,17uyarma noktalar. Ancak, bu kadar 2000’lerin DNA kırılmalara ve sensitizers içinde olmayan indüklenen gösteren çok sayıda rapor ortaya çıktı ne zaman gerçek etkisi ile daha yüksek yoğunluklu lazerler sıkıca odaklanmış ışınlar bu birleşimi, hissettim değil UV-A aralığı6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26ve artık görünür dalga boylarında 488 nm27gibi bile. Bu gelişmeler daha yaygın ticari sistemleri bir dizi mikro-ışınlama tekniğine kabulü için izin. Bu gelişmelere paralel olarak, İki fotonlu teknikleri de DNA hasarı kesin indüksiyon izin ortaya çıktı; Bu gelişmeler burada tartışılan değil rağmen bu metodolojileri9,28,29,30tartışırken inceleme makaleler vardır.

Confocal mikroskoplar çok odaklı UV ışık ve floresan proteinlerin DNA onarım proteinlerin gerçek zamanlı izleme izin vermek için yaygın kullanılabilirlik sunma yeteneğine sahip geçerli erişilebilirlik ile mikro-ışınlama teknikleri içine geliştiğini DNA hasarı yanıt ve onarım yolları incelenmesi için güçlü araçlar. Ancak, kullanıcılar DNA hasarı nesil lazer dalga boyu ve alt nükleer bölgesine uygulanan güç son derece bağımlı olduğunu unutmayın gerekir. UV-C kullanımı (~ 260 nm) dalga boyu doğrudan DNA uyarma ve yüksek seçicilik UV photoproducts7,8indüksiyon için izin verir. UV-B ve UV-A dalga boylarında DNA hasar (temel lezyon, SSBs ve DSBs) karışımları üretmek,7uygulamalı güç ve hücresel arka plan bağımlı için kullanılmaktadır. Endojen dezenfeksiyon ve anti-oksidan düzeyleri hedef hücrelerde bu boyları tarafından üretilen DNA hasarı karışımları etkisi altına alabiliyor. Ayrıca, eksojen dezenfeksiyon (BrdU, vb) kullanımı DNA hasarı indüksiyon için gerekli enerji düşürerek yardımcı olabilir. Ancak, bu ajanların kendileri tarafından DNA hasar neden olabilir ve bunların kullanımı kullanıcı tarafından dikkat edilmesi gereken istenmeyen etkiler üretmek onlar hücre döngüsü ve Kromatin yapısı, değiştirmek. Bu nedenle, mikro-ışınlama DNA hasarı yanıt ve onarım çalışması için kullanılmadan önce dikkatli bir değerlendirme DNA onarım yolun faiz, dalga boylarında kullanıma hazır ve oluşturulan DNA hasarı karışımı gereklidir.

Burada, iki yaygın olarak kullanılan dalgaboyu, 355 lazer mikro-ile gerçekleştirilir nm ve 405 nm, bu dalga boyu ve bu hasar karışımları var tamiri inceleyerek üzerinde etkileri tarafından indüklenen DNA hasarı karışımları göstermek için sensitizers olmadanSSBs ve DSBs. kullanıcılar bu dalga boylarında kırılmalara veya temel lezyonlar tek bir tür oluşturmak değil bilmeniz gerekir. DNA onarım yolları arasında ayırımcılık için kullanıcılar gerekir dikkatli bir şekilde uygulanan güç çekirdeği belirli bir bölge üzerinde kontrol ve birden çok strand sonu işaretçileri ve DNA lezyon antikorları kullanarak indüklenen zarar karakterize. Doğru uygulanmış ve karakterize lazer mikro-ile bazı türler DNA hasar onarım temel lezyonlar ve SSBs veya DSBs, bazı özgüllük ile değerlendirmek Vikimapya, zenginleştirebilirsiniz. Bu nedenle, biz bırakmak kullanıcı tekrarlanarak lazer mikro-ile gerçekleştirmek, tarafından uygulanan lazer doz indüklenen DNA hasarı karışımları karakterize ve veri analizi gerçekleştirmek bir yöntem sağladı.

Protocol

1. hücre kültürü ve istikrarlı hücre üretimi büyümek CHO-K1 hücrelerde en az gerekli orta % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiştir. Hücreleri oksijen kuluçka %5 CO 2 37 korumak ° C. Transfect CHO-K1 hücreleri içeren bir C-terminal ile insan XRCC1 plazmid DNA’ın 1 µg ile yeşil flüoresan protein (GFP) etiket üretici takip bir ticari transfection reaktif kullanarak ' s yönergeleri. Seçin CHO-K1 hücreleri stabil 800 µg/mL geneticin kullanarak insan XRCC1 GFP füzyon ifade ve destekli floresan hücre (FACS) sıralama kullanan XRCC1 GFP ifade kesimin zenginleştirmek. Plaka hücreleri yaklaşık % 75 veya daha fazla confluency ertesi gün ulaştıkları mikro-kültür gemi coverglass dipleri ile ışınlanmış olmalı. Hücreler arasında bazı alanlarda özellikle kayıt aynı görüntü alanı (anlatıldığı Bölüm 3.2) dönmek için kullanıyorsanız arzu edilir. 2. Mikroskop kurulum bir lazer tarama seçin confocal mikroskop mikro-ışınlama/photostimulation için uygun lazer ve optik ve kontrol yazılımı ile donatılmış. Deneyler kullanım 355 nm lazer, fiber birleştiğinde-galvanometre photoactivation miniscanner içerecek şekilde değiştirilmiş confocal mikroskobu tarama bir lazer sundu ve üretici ile kontrol ' s kontrol ve analiz yazılımı. Bu sistem içinde kullanıcı tarafından atanan bölge ilgi (ROI) mikro-ışınlama photoactivation miniscanner (355 nm lazer) veya standart confocal galvanometre (405 nm lazer) kullanarak gerçekleştirebilirsiniz. Mikro-ışınlama, mikro-ışınlama lightpath tüm optik bileşen için seçilen dalga boyu uygun sağlanması için kullanılacak dalga boyu seçin. Not: Sunulan sistem bir 40 × C-Apochromat (sayısal diyafram (NA) 1.2) yağı daldırma objektif 355 nm mikro-ışınlama için bir UV filtre küp ile birlikte ve bir 20 x C-Apochromat (NA 0,75) kuru hedefi standart confocal lightpath kullanarak uygular 405 nm mikro-ışınlama. 20 × amaç kurulumunda kullanılan 355 nm dalga boyu ile uyumlu değildir; Bu nedenle biz kullanılan 40 × için 355 nm sadece. Kuru amacı istimal o için zarar ayirt iletişim kuralları aşağı daldırma yağ temizlik olmadan uygulanmasına olanak sağlar, bu yüzden biz bu amaca uygun olduğunda kullanmaktadır. Yapılandır mikroskobu mikro-ışınlama için deneme. Deneyler arasında tutarlılık sağlamak için standart bir yapılandırma mikro-ışınlama her türü için kullanılacak mikroskop bileşenlerinin belirleyin. Bu ayarları içinde mikroskop hazır ayar olarak kaydetmek ' yazılımı, mümkünse çalışan s. Not: sunulan sistemde hücreleri mikro radyasyona maruz ve tek yönlü tarama, tarama çözünürlüğü 1024 x 1024 piksel x tarama zum, 1 kullanarak yansıma 8 kare / saniye (fps) ve iğne deliği ve sondaj ile kare hızı ayarlamak için yaklaşık 4 havadar birimleri (AU), olarak 488 nm lazer (69 µm) için kararlı. Bu açık iğne deliği ayarı alt lazer güçler görüntüleme ve photobleaching azaltarak kullanımına izin veren her görüntü yakalanan ışık miktarını en üst düzeye çıkarmak için seçildi. 3. Mikro-ışınlama lazer yer hazırlanmış kültür çanak, ilgi, üstüne belgili tanımlık mikroskop sahne ve kilit güvenli bir şekilde yerine hücreleri içeren. Varsa, bir sahne-üst kuluçka makinesine odacıklı slayt yerleştirin ve % 5 CO 2 37 ° C’de hasar indüksiyon sırasında korumak. Görüntüleme veya uzun oturumları görüntüleme canlı hücre timelapse için en önemli adımdır. Aksi takdirde yer hücrelerin mikroskop üzerinde sahne ve ışınlama oda sıcaklığında gerçekleştirmek (~ 25 ˚C) ve hızlı bir şekilde hücreleri bir kuluçka %5 CO 2 37 ° C’de dönün. Kayıt araştırmacı fiksasyon, boyama veya diğer işlemleri gerçekleştirdikten sonra aynı konuma dönmek izin vermek için görüntü alanları. Kaydı bozuk alanları bir kodlanmış, otomatik mikroskop sahne kullanarak gerçekleştirmek veya kültür coverglass gemi XY yerlerin bir kabartma veya etiketli ızgara ile hücre. Kültür gemi (örneğin, coverglass veya kuyu arasında bariyer köşesinde) tanınabilir bir özellik seçin yazılım görüntü kaydı, kullanarak, bir görüntü toplayabilir ve XY konumu kayıt . Bu hizalama ve seçili alanları numune hazırlama takip XY yerlerinin kayıt için sağlayacaktır. Elle kayıt kullanılıyorsa, kılavuz veya kazınmış Mekanlar her alan için el ile sahne alanı’nda Kayıt Yönlendirme ve yerleşim yemeğin için dikkatli olmak kaydetme. Hücre kültür gemiler için hiçbir tanımlayıcı özellik yoksa, hücre morfolojisi ve yoğunluk görsel denetim tarafından bozuk alanları tanımlayın. Daha sonra görüntüleme sırasında tanınabilir olmak yeterince farklı özelliklere sahip alanları seçmek için dikkat. Not: Bu yönlendirme ve kültür damar bölgesinin olmadığı sürece sıkı bir şekilde kısıtlı gerçekleştirmek için zaman alıcı olabilir. Mikro-ışınlama için bir alan seçin ve örnek odaklanmak. Fluorescently etiketli proteinler ifade hücreleri için odak düzlemi ile maksimal nükleer kesit faiz floresan kanalı seçin. Hücreler için değil ifade protein etiketli veya olmayanlar için net nükleer yerelleştirme, faz kontrast veya fark girişim kontrast (DIC) görüntüleme doğru odak düzlemi bulmak için kullanılabilir. ​ Not: faz kontrast ve DIC görüntüleme yararlı bir özelliği odak düzlem örnek hareket ederken, aynı özellik açık veya koyu bağlı olarak göreceli odak düzlemi görünebilir gerçektir. Gibi bir çekirdekçik çekirdeğin içinde açık bir özellik seçin ve görünüşte bu değişiklik kesilmediğini gözleyerek odak düzlemi yukarı ve aşağı hareket ettirin. Gerçek odak düzlemi içinde karanlık ışık geçiş yalan olur. Örnek odaklanmak için seçilen özellik keskin kontrast olan odak düzlemi seçin. İlgi alanın konumu kayıt. Belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı içinde 3 x 3 piksel kare yatırım Getirisi oluşturmak, bu ROI hasar görmüş gibi bir hücre çekirdeği yerleştirin ve hasar yatırım Getirisi bu yatırım Getirisi ayarlamak. Hasar ROI konumunu da dahil olmak üzere bir ön hasar görüntü toplamak. Floresan proteinler, kullanmayın deneyler elde etmek için tanımlamak ve çekirdeği hasar için kaydetmek için bir faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) aydınlık alan görüntü. Floresan proteinler, kullanarak canlı hücre deneyleri için aydınlık alan ve floresan kanal faiz (yani, lazer çizgi 488 nm GFP, lazer çizgi 561 nm RFP uyarma için uyarma için) protein içeren bir görüntü elde etmek. CHO-K1 XRCC1 GFP kullanarak deneyler, Floresans 488 nm lazer çizgi tarafından heyecan iletilen DIC aydınlık alan kanal ile aynı anda toplanan. İnitiate lazer hasar. Sunulan sisteminde denetim lazer doz toplam süre tarafından harcanan hasar ROI tarama. Galvanometre 355 nm lazer için bir sabit tarama hızda çalıştığından, lazer doz art arda seçilen hasar ROI tarama harcanan süre tarafından kontrol edilir: verilerde, burada, mikro-ışınlama 355, sunulan nm 2 ve 10 saniye boyunca yapılır. Buna ek olarak, tarama hızı oransal olarak 405 nm lazer doz kontrol ve seçili zarar yatırım Getirisi bir tarama gerçekleştirin. Veri pBurada içerledim, 8 ve 0.5 fps için mikro-ışınlama 405, kullanmak nm. Çünkü lazer tarama sırasında her pikseli üzerinde daha az zaman harcıyor 8 fps bir tarama hızı 0.5 fps, daha düşük bir lazer doz sağlar. Her iki lazerler % 100 güç çalışır. 3.7 için yönergeleri doğrudan lazer güç ölçme üzerinde bakınız. Not: Her bireysel mikroskop sistem lazer güç belirlenmiş bir yatırım Getirisi için benzer nasıl 355 nasıl teslim içinde farklı olabilir nm ve 405 nm sunulan sistemdeki farklı. Kullanıcı-ecek lüzum mikroskop sistemlerine yönelik bu yordamı belirlemek ve bu parametreleri tanıtımı onların yöntemleri bölümleri rapor. Timelapse resim alma aydınlık alan ve floresan kanalların canlı hücre görüntüleme için gerçekleştirin. Süresi ve veri toplama, ideal olarak zarar yatırım Getirisi, floresan protein ve onun ayrılma birikimi deneme süresi boyunca esir alma en iyi duruma getirmek için timelapse sıklığını ayarlayın. XRCC1 GFP kullanarak deneyler toplanan görüntüleri her 30 saniyede 20 dakika. ​ Not: timelapse görüntüleme frekans analizi birikimi ve ayrılma karmaşık hale getiren fluorophore, photobleaching tarafından sınırlı olabilir. Photobleaching hasarsız hücreleri sırasında timelapse gözlemleyerek ve hasarsız bu hücrelerde floresan sinyal kaybı en aza indirmek için edinme Koşulları ayarlama tarafından değerlendirilebilir. Kullanıcılar bu timelapse her karesini hasarsız hücrelerinin hasarlı hücreleri floresan yoğunluklarda normalleştirme için sinyal kaybı telafi etmek bu yüzden bazı photobleaching kaçınılmaz olabilir. Zaman ders tamamlandıktan sonra hücre hasarı için yeni bir alan seçin veya 4 bölümde açıklandığı gibi daha fazla analiz, hasarlı hücreleri tamir. Devam mikro-ışınlama ve hasarlı hücreleri için istediğiniz sayıyı ulaşılana kadar timelapse Imaging. ​ Not: hücre hücre heterojenite yanıt olarak indüklenen zarar değerlendirmek için toplam 10-25 hücre seçili koşul başına zarar öneririz. En confocal sistemleri birden fazla hücre her mikro-ışınlama sırasında zarar kullanıcılara olanak sağlar, ancak bu en yoğun işe zaman analizi çok sayıda hücre üzerinde karmaşık hale getirebilir sendeleyerek hasar başlatma kez ya da ayrılma zamanı getirir hızlı olaylarıdır. Bazı sistemlerde, her bağımsız yatırım Getirisi tarafından alınan lazer doz birkaç ROIs üzerinden aynı anda hasar indüksiyon azaltabilir. Sürece bu zamanlama/güç sorunları doğrudan kullanıcı tarafından ele alınmaktadır, bu nedenle, bu hücreleri tek tek bükülmelerle önerilir. Ayirt (Eğer), ile analiz gerçekleştirmek hasar ve ya hemen açıklandığı gibi hücreleri, düzeltmek için 4 bölüm veya hücreler seçili zaman artırımları ile (yani, 1, 5, 10 veya 20 dk) için onarmak izin. İstenen süre sona erdiğinde, düzeltmek ve ayrıntılı olarak bölüm 4 hücreleri leke. Durum çözümlemesi için genel hücre sayısını artırmak, bir çok alan zamanlı Kurs sonrası hasar yanıt oluşturmak için kültür gemi içinde ek alanlar zarar için. Kayıt XY konumu her alan ve hasar oluştuğu saat. İstenen toplam sonra geçtiğinde onarım, tamir ve hücreleri detaylı olarak leke. Seçili dozda protein alımı gözlemleyerek sonra ölçü ve rapor lazer güç seviyeleri sonrası lif ve doğru bir şekilde karakterize ve rapor sonrası amaç lazer dozlarda. Bir kompakt dijital güç metre ve iki farklı fotodiyot sensör kafa bir sonrası fiber çıkış ölçmek için doğrudan lazer fiber için birleştiğinde ve diğer post-objective çıkış ölçmek için mikroskop sahneye yerleştirilir. Lazer güç ölçmek, sensör istenen yapılandırmada (sonrası lif veya post-objective) yerleştirin ve güç ölçer tarafından yapılan ölçümler kaydederken, yukarıda açıklandığı gibi mikro-ışınlama gerçekleştirmek için. Güç metre örnekleme oranı hızlı denemenin yeti ölçme aygıtı doğru şekilde uygulanan doz algılar sağlamak için birden çok yineleme çalıştırmak gerekli olabilir bu yüzden çok hızlı mikro-ışınlama olayları yakalamak için yeterli olmayabilir unutmayın. Not: 355 nm lazer için bir ortalama en yüksek gücü yaklaşık 5 mW sonrası lif ve yaklaşık 19 µW sonrası amaç şiddetindeydi. 405 nm lazer için mikro-ışınlama, güç metre 0.01 s maksimum örnekleme oranı ve ortalama en yüksek güçler 1.5 üstesinden gelmek için 30 yineleme döngüleri içinde gerçekleştirilen mW ve 2,4 mW ölçülen tarama hızı saniyede 8 ve 0.5 kare kullanarak , sırasıyla. Her güç metre farklıdır. Kullanıcı-ecek lüzum operasyonel dalga boylarında ve örneklendirme oranı için onların bireysel yeti ölçme aygıtı belirlemek. 4. Yordamlar boyama ayirt analiz strand sonu indüksiyon Eğer boyama tarafından. % 3.7 ile düzeltme hücreleri formaldehit (dikkat) fosfat serum (PBS) 10 dk. aspiratı formaldehit çözüm ve yıkama 3 kez ile PBS için arabelleğe alınmış. Protokol burada geri hücrelerdeyse PBS yerleştirerek durdurulabilir ve hücreleri 4 ˚C 1 hafta kadar saklanabilir. Uyarı: Toksik ve kanserojen formaldehit. Giyim uygun kişisel koruyucu ekipman ve toksik madde kurumsal çevre sağlık ve güvenlik prosedürleri tarafından talimat olarak atmayın. % 0.25 kullanarak hücreleri permeabilize 3 kez PBS ile 10 dakika oda sıcaklığında (RT) ve daha sonra yıkama için PBS Triton X-100. 30 dk içinde dik, %1 sığır serum albümin (BSA) içeren PBS için kuluçka tarafından blok non-spesifik antikor bağlama ΓH2AX karşı birincil monoclonal antibody ve 53BP-1 hem de seyreltilmiş RT, 1 h için % 1 BSA içeren PBS 1:750 ve sonra PBS ile 3 kez yıkayın karşı birincil poliklonal antikor Incubate. Incubate hücreleri Alexa 488 keçi Anti-fare ve Alexa 546 keçi Anti-tavşan hem seyreltilmiş RT, 1 h için % 1 BSA içeren PBS 1:2000 ve sonra PBS ile 3 kez yıkayın. Leke DAPI, 10 mg/mL solüsyon ile nükleer DNA (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dikkat) 5 min veya kullanım karşılaştırılabilir nükleer boya için 1: 5000 PBS içinde seyreltilmiş ve sonra PBS ile 3 kez yıkama. Uyarı: Toksik ve mutajenik DAPI. Uygun kişisel koruyucu donanımları ve kurumsal çevre sağlığı ve güvenliği yordamlar tarafından talimat olarak toksik madde atmayın. Geri lekeli hücreleri üzerine yer PBS veya PBS + % 0,1 sodyum azid (uyarı). İletişim kuralı burada durdu ve hücreleri 4 ˚C birkaç gün için depolanan veya resim alma bölümünde 5 geçin. ​ Dikkat: sodyum azid zehirli. Uygun kişisel koruyucu donanımları ve kurumsal çevre sağlığı ve güvenliği yordamlar tarafından talimat olarak toksik maddelerin atılması. Temel lezyonlar veya DNA analiz indüksiyon adducts Eğer boyama tarafından. Düzeltme ve buz gibi metanol (uyarı) için -20, 20 dk hücrelerde permeabilize ° C. Uyarı: Toksik ve yanıcı metanol. Uygun kişisel koruyucu donanımları ve kurumsal çevre sağlığı ve güvenliği yordamlar tarafından talimat olarak toksik madde atmayın. Beni Aspire edinthanol ve tamamen 15 dk. Protokolü kurumaya örnek burada durdurulabilir ve hücreleri-20 ˚C depolanan kuru 3 güne kadar izin. PBS 15 dakika süreyle hücrelerde rehydrate Denature RT ve yıkama 3 kez PBS ile 45 dk için 2 N HCl (dikkat) kullanarak DNA. Dikkat: HCl aşındırıcı. Uygun kişisel koruyucu donanımları ve aşındırıcı madde kurumsal çevre sağlığı ve güvenliği yordamlar tarafından talimat olarak atmayın. 50 mM Tris-HCl pH 8.8 5 min için PBS ile 3 yıkar ardından Nötrleştir. Incubate hücreleri engelleme arabelleği % 0,1 ile % 5 normal keçi serum PBS RT. 1 h için Triton X-100 yapılan 3 kez PBS ile 8-oxo-2´-deoxyguanosine (8-oxodG, 1: 400) veya cyclobutane pirimidin dimer (GBM, 1:1, 000) keçi serum engelleme arabellek için 1S RT ve sonra yıkama için birincil antikorlar ile Incubate. Kuluçkaya Alexa 488 keçi Anti-fare keçi serum engelleme arabellek için 1S RT, bir 1:2000 oranında hücrelerle ve PBS ile 3 kez yıkayın. Leke nükleer DNA 1: 5000 DAPI (10 mg/mL) için 5 dk içinde PBS kullanarak ve PBS ile 3 kez yıkayın. Odacıklı coverglass kullanarak, PBS veya PBS + % 0,1 sodyum azid geri lekeli hücreleri koyun. İletişim kuralı burada durdu ve hücreleri 4 ˚C birkaç gün için depolanan veya resim alma bölümünde 5 geçin. Ek bir coverglass-ebilmek var olmak konulmak üstünde tepe-in kültür gemi Alternatif olarak, tercih edilen montaj orta, hücrelerde mount. Bir kez tedavi bağlı hücreler 4 ˚C uzun süre saklanabilir. 5. Görüntü edinme ayirt deneyleri için coverglass alt kültür geminin etanol ile temiz ve geri confocal mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin. Oryantasyon ve gemi Sahne Alanı’ndaki konumunu karşılık gelen yönlendirmeye ve ne zaman zarar indüklenen pozisyon kaydedilen emin olun. En iyi kayıt ve görüntüleme sağlamak için kültür gemi güvenli. Seçili kayıt tekniği kullanarak bulun daha önce görüntüsü alanları (açıklandığı 3.2). El ile kayıt için kılavuz odak ve işaretleri tanımlayan bul getirmek ile kazınmış bir kılavuz, bir coverglass kullanarak. Hasarlı hücreleri bulmak için XY koordinatları kaydedilmiş kullanma. Görüntü tabanlı otomatik kayıt için başvuru adım 3.2.1 olarak kullanılan yapısal özelliği bulun ve yakından mümkün olduğunca kaydedilen görüntü için geçerli canlı mikroskop görünüm hizalayın. Hizalanmış bir kez geçerli XY mikroskop sahne konum ölçmek ve başvuru yansıması XY konumu karşılaştırın. İki konum arasında doğrusal mesafe X ve Y uzaklığı tanımlar. Bu uzaklık ışınlanmış hücre içeren görüntü alanları tanımlamak için kaydedilen her XY konumu için geçerlidir. Bu ofset işlev içinde mikroskop kontrol yazılımı otomatik veya el ile gerçekleştirilen. El ile hiçbir uygun kayıt noktaları tespit edilmesi, hücreleri slayt tarama ve önceden tanımlanan Ökaryotlar arasındaki farklılıklar bulmak bulun. (2.3 bölümünde ayarlama ve 3.3 bölümünde odaklanarak) bir aydınlık alan görüntü de dahil olmak üzere tüm lekeli hedefleri toplamak için uygun mikroskop ayarları kullanarak görüntüleri. Sunulan deneylerde, çok kanallı görüntüler aşağıdaki uyarma lazer çizgileri ve fluorophores kullanılarak toplanmıştır: 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 ve iletilen DIC aydınlık alan) ve 561 nm (Alexa 546). Tüm lazer lazer dalga boyu ve gücü iletimini denetleyen bir tek acousto optik ayarlanabilir filtreden geçmek. 6. Canlı hücre görüntü analizi mikro ışınlanmış sitelere floresan protein alımı açık bir görüntü analizi uygulama (yani, NIS öğeleri ya da ImageJ) Albümdeki satın aldı. Gerekirse, öncesi ve sonrası hasar indüksiyon bir tek görüntü sırası oluşturmak için timelapse resmi öncesi ışınlama resmi birleştirir. Kullanıcılar göstermek işe alım radyasyonlu alana floresan yoğunluğu değişiklikleri ölçerek tüm çekirdek ölçülen floresan yoğunluğu için göreli (temsilcisi Results 1 rakam görmek B. ). Her hücre ölçülecek ilk başvuru çekirdek temsil eden yatırım Getirisi oluşturmak. Çekirdeği kadar yapmak piksel içerir floresan sinyal bir eşik algoritma kullanın ve sonra bu alan bir yatırım Getirisi dönüştürün. Gerekirse, yatırım Getirisi aydınlık alan bir referans olarak kullanarak el ile çizilebilir. Nükleer alan doğru bir şekilde yatırım Getirisi ile kaplı emin olmak için zaman boyunca yatırım Getirisi ayarlamak ve her çerçeve için bu yatırım Getirisi içinde sinyal floresan ortalama Floresans yoğunluğunu rapor. Ölçülecek her hücre için 6 x 6 piksel ROI oluşturmak ve o zaman tabii her çerçeve için yatırım Getirisi hasar üzerine getirin. Bu büyük yatırım Getirisi analizi için yatırım Getirisi hasar oldu. Ortalama yatırım Getirisi floresan yoğunluğu her çerçeve için raporu. Not: Çoğu ticari görüntü analiz yazılımı 2B nesne izleme için modülleri içerir ve daha hızlı iş akışı ve daha yüksek işlem hacmi (bkz: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/) kolaylaştırmak kullanıcı tarafından geliştirilen makro ImageJ veya FIJI için bir dizi. Ortalama hasar ROI floresan yoğunluğu timelapse her çerçeve içinde karşılık gelen başvuru yatırım Getirisi olan için normalize. Burada, kötü nükleer floresan yoğunluğu başvuru yatırım Getirisi olarak kullanılır (temsilcisi Results 1 rakam görmek). normalleştirme gerçekleştirilen ortalama ortalama başvurusundan ROI floresan yoğunluğu çıkararak zarar yatırım Getirisi floresan yoğunluğu veya ortalama bölerek ROI zarar floresan yoğunluğu ortalama referans ROI floresan yoğunluğu. Not: Normalleştirme bölümü tarafından öngörülemeyen, durumlar çok düşük başvuru yoğunluk değerleri ile kullanıldığında sonuçlar olabilir. En az iki denetim, hasarsız hücreleri yanı sıra tüm hasarlı hücreleri için yineleyin. Denetimi hücre sonuçları gerekirse daha fazla normalleştirme için kullanılabilir. Grafik değişiklikleri işe alım dinamiklerini deneysel tedavi bir fonksiyonu olarak göstermek için zaman içinde yoğunluk değerleri normalleştirilmiş. 7. Görüntü analiz ayirt tarafından algılanan protein alımı açık bir görüntü analizi uygulama öncesi ve sonrası hasar Albümdeki. Ön hasar görüntüler ROI(s) mikro-ışınlama için kullanılan hasar içerir. ROI(s) Kopyala Yapıştır hedeflenen hücreleri tanımlamak için sonrası hasar görüntülere. 6 x 6 piksel yatırım Getirisi analizi protein alımı için oluşturmak ve bu yatırım Getirisi yatırım Getirisi hasar konuma yerleştirin. Bu büyük yatırım Getirisi analizi için yatırım Getirisi hasar oldu. Yatırım Getirisi floresan yoğunluğu ortalama hasar raporu. Karşılık gelen başvuru yatırım Getirisi olan için ortalama hasar yatırım Getirisi floresan yoğunluğu normalleştirmek. Burada, hasarlı hücre ortalama nükleer floresan yoğunluğu başvuru yatırım Getirisi olarak kullanılır (temsilcisi Results 1 rakam görmek). Yatırım Getirisi başvuru çekirdek tanımlamak için DAPI İşaretimle eşik algoritma kullanarak oluşturmak ve sonra bu alanı bir yatırım Getirisi için dönüştürün. Ortalama başvuru yatırım Getirisi floresan yoğunluğu rapor. Normalleştirme yapılabilir kötü hasar ROI floresan yoğunluğu ortalama başvurusundan ROI floresan yoğunluğu çıkarılarak veya kötü hasar ROI floresan yoğunluğu bölen ortalama gönderimli ROI floresan yoğunluğu. Not: Normalleştirme bölümü tarafından öngörülemeyen, durumlar çok düşük başvuru yoğunluk değerleri ile kullanıldığında sonuçlar olabilir. Tüm hasarlı hücreleri için yineleyin ve yukarıda açıklandığı gibi en az iki kontrol hücreleri üzerinde aynı Çözümlemeyi gerçekleştirmek. Grafik için her mikro-ışınlama olay değişiklikleri protein alımı veya DNA hasarı tür deneysel tedavi bir fonksiyonu olarak göstermek için zamana karşı ölçülen yoğunluk değerleri normalleştirilmiş.

Representative Results

İndüklenen DNA hasarı karakterizasyonuTemel lezyonlar ve kırılmalara indüksiyon seçili nükleer bölgesine uygulanan lazer doz bağımlı ve hücre modeli hücresel microenvironment7kullanılır. Floresan proteinler erimiş gibi XRCC1, 53BP1, Ku70 veya Rad51 protein onarmak için sağlamak yararlı tek ve Çift Kişilik strand bir hasar ROI yukarıdaki içinde floresan bir protein birikimi görmek için gereken en az enerji oluşturmak için sonu işaretçileri arka plan Floresans9,19,31. Bir yanıt neden koşulları bulunca, o belirli dalga boyu ve doz tarafından indüklenen zarar karışımı ayırdetmek önemlidir. Zayıflama doz ve süre sonunda kullanılan dalga boyu karmaşık hasar karışımları oluşumunu en aza indirmek kullanıcı izin verebilirsiniz. UV-A aralığı düşük lazer dozlarda ağırlıklı olarak SSBs ve temel lezyonlar, SSBR ve BER yolları10,28eğitim için uygun küçük bir miktarda üretmek için gösterilmiştir. Dozu artan daha karmaşık temel lezyonlar, oksidatif oluşturur ve UV indüklenen ve daha fazla sayıda DSBs7,10neden olmaktadır. İndüksiyon DNA hasar tek bir türün belirli DNA onarım yolları incelenmesi için arzu edilir iken, kullanıcıların temel lezyonlar veya DSBs çok daha sık olmak SSBs gibi belirli bir lezyon ile DNA lezyonlar karışımı inducing daha yüksektir. Hidrojen peroksit (H2O2) ya da metil methanesulfonate (MMS)32gibi kimyasal maddeler tarafından indüklenen DNA hasarı karışımları benzer. Kullanıcılar karışımları zarar sonuçları ortaya çıkabilir ve doz ve lezyonlar indüklenen zarar sitesinde dikkatli karakterizasyonu tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilir onların sonuçları sağlamak gerekli bildirdiğimde bilmeniz gerekir. Mikro-ışınlama çalışmalarda XRCC1 GFP genellikle temel lezyonlar ve SSBs9,28indüksiyon bir marker kullanılır. XRCC1 SSB onarım (SSBR) önemli bir rol oynadığı bir iskele protein ve temel eksizyon (BER) onarmak ve nükleotid eksizyon tamir (NER)33,34,35 gibi diğer onarım yolları da katılmaktadır . DNA tamiri, anahtar protein poly(ADP-ribose) polimeraz 1 (PARP-1), DNA polimeraz β dahil olmak üzere, bir dizi ile etkileşim içinde önemli bir denetleyici rol oynar (Pol β) ve DNA ligaz III. Biz XRCC1-stabil CHO-K1 hücrelerde ifade SSBs ve DSBs oluşturmak için gerek duyulan lazer dozlarda belirlemek için GFP kullanılmaktadır. Biz ilk kez XRCC1 GFP gözlemlenebilir bir işe her dalga boyu (şekil 1) için ikna etmek için gerekli en düşük doz tespit. 355 nm dalga boyları için 2 s yaşamak zamanla tanımlanmış hasar ROI (şekil 1A) arka plan üzerinde tespit DNA hasarı indüksiyon gösteren ki ROI içinde artan bir floresan sinyal oluşturulan. İçin 405 nm, bir 8 fps tarama hızı gözlemlenebilir bir işe alım için yatırım Getirisi (şekil 1A) hasar oluşturmak için ihtiyaç vardı. Doz daha sonra arttı (10 s 355 nm ve 0.5 fps için 405 nm) daha yoğun oluşturmak için ROI (şekil 1A) zarar. İşe Alım ve muhafaza edilmesine XRCC1-GFP indüklenen zarar yerinde sonra timelapse görüntüleme tarafından izlenen. Ayrılma indüklenen zarar sitesinden proteinin kez BER veya SSBR tamamlanması için bir işaret olarak kabul edilir iken bir protein DNA hasarı yerinde tutma devam DNA tamiri, gösterebilir. Ancak, lazer kaynaklı DNA hasarı sitelerden XRCC1 ayrılma onarım tamamlanması ile bağlama hiçbir açık delil oldu. Siteye zarar protein alımı üzerinde tüm çekirdek (şekil 1B) ölçülen ortalama floresan sinyal floresan sinyal bozuk ROI içinde ortalama yoğunluğu bildirerek ölçülür. Diğer normalleştirme teknikleri ilgi protein hücresel dağıtım bağlı olarak istihdam edilebilir olsa da bu tür normalleştirme adresi şiddeti dalgalanmalar nükleer sinyal içinde yardımcı olur. Burada, böylece zarar yatırım Getirisi için sinyal yeniden dağıtılması normalleştirme nükleer alanına ölçer XRCC1 nükleer kompartımanda yerelleştirilmiştir. Yatırım Getirisi ortalama floresan yoğunluğu sonra ön hasar görüntü de dahil olmak üzere ve zaman (şekil 1C) bir fonksiyonu grafiği çizilecek timelapse her resim için kaydedilir. O zaman DNA baz lezyonlar oluşumunu incelemek için iki seçili lazer doz tarafından indüklenen zarar daha fazla karakterize. İlk olarak, CPD, UV kaynaklı bir hantal lezyon oluşumu NER türü lezyonlar (Şekil 2A) için bir işaretleyici olarak ayirt tarafından probed. Sonra oxidatively indüklenen temel lesion8 oxodG BER türü lezyonlar (Şekil 2B) için bir işaretleyici olarak probed. Her iki dalga boylarında düşük doz pozda CPD lezyonlar önemli hiçbir artış gözlendi (2 s 355 nm ve 405 için 8 fps için nm), yüksek doz ise her iki dalga boyu tedavi (10 s 355 nm ve 405 için 0.5 fps için nm) floresan içinde önemli bir artış gösterdi hasar ROI (Şekil 2A) içinde gözlenen sinyal. Bir dağılım çizim CPD Roi hasar oluşumu ve algılama dalga boylarında ve CPD lezyonlar düşük düzeyde düşük dozlarda mevcut olabilir, ama yük önemli ölçüde olmayabilir gösteren doz, her bozuk hücre gösterir heterojenite için yoğunluk demek daha yüksek bir doz uygulanana kadar algıladı. Scatterplot da hasar karışımları doğru miktar sınırlayabilir antikor saptama bu verimsizlik önerir. Bu daha fazla işaret 8-oxodG tarafından oxidatively indüklenen DNA lezyonlar algılama içinde vurgulanır. Floresan sinyal zarar içinde hiçbir net artış yatırım Getirisi için 8-oxodG dalga boyunda veya kullanılan doz (Şekil 2B) gözlenmiştir. Bu iş için kullanılan antikor önceki yayınları9,10,36ile tutarlıdır; Ancak, bu sınırlamalar içinde 8-oxodG antikorlar37,38ile oluşumu gözlem olabilir unutulmamalıdır. Onay oxidatively indüklenen lezyonlar eksikliği aynı zamanda 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), enzim DNA10′ dan sorumlu 8-oxodG kaldırılması için işe alım gibi ikinci bir işaret tarafından tavsiye edilmektedir. Biz DNA hasarı sitemize OGG1 işe alım gözlemleme; Ancak, oxidatively indüklenen DNA hasar seviyesinin düşük oluşumu tamamen kullanılabileceği belirlenmemiştir. Son olarak, iki işaretleri, γH2AX ve 53BP-1, selecte kullanarak DSBs oluşumu muayened lazer dozlarda ayirt tarafından (şekil 3 & 4). ΓH2AX yaygın bir iplikçik sonu işareti olarak kullanılır, ancak DSBs için onun özgüllüğü sayısı raporları39,40sorguladı. Ayrıca, bir iplikçik Break sinyal lokalizasyonu nedeniyle bu sinyal yayma sınırlı olabilir bu yüzden strand sonu sitesinden yayar bir fosforilasyon olaydır. Bu nedenle, γH2AX 53BP-1 ile birleştirerek DSB formasyonu içerisinde hasar yatırım Getirisi daha doğru değerlendirilmesi için sağlar. ΓH2AX ve 53BP-1 mikro-ışınlama için dalga boyu ve doz bağımlı yanıttır. Düşük doz (2 s) uyarımı de 355 nm 5 ve 20 dk ve her iki işaretleyiciyi de bir zayıf ve değişken yanıt 10 dk sonrası radyoterapi (şekil 3A) yanıt aydınlığa çıkartıyor. Yüksek doz (10 s) 355 nm mikro-ışınlama zarar yatırım Getirisi 5, 10 ve 40 dk (şekil 3B) azalır 20 dk sonrası radyoterapi içinde artan bir floresan sinyal neden oluyor. Bu sonuçlar bu dikkatli 355 nm doz titrasyon gerekli çapraz-onarım yolları, uyarılması en aza indirmek için çift strand sonu işaretçisi γH2AX erken zaman noktalarda azaltılmış tespiti tarafından gösterildiği gibi gösterir (< 20 dk), düşük doz uygulanan. Yüksek doz (0.5 fps) 405 nm lazer stimülasyon (şekil 4) ve düşük (8 fps) kullanarak benzer deneyler yapıldı. Bu dalga boyu 53BP-1 ve bu doz neredeyse tek ve Çift Kişilik kırılmalara karmaşık bir karışımı oluşturmak gösteren uygulanan doz ne olursa olsun γH2AX için önemli hasar ROI içinde floresan yoğunluğu birikimi gözlenmiştir hemen sonra indüksiyon DNA hasar (şekil 4). Ayrıca, 405 nm Haritayı pan-nükleer γH2AX hasar indüksiyon (şekil 4B, alt) 10 dk içinde boyama bir artış yüksek dozda bu yatırım Getirisi hasar tespiti için rapor, 53BP-1 birikimi ise daha zorlaştırır hasar ROI içinde yer. Bu sonuçlar açıkça 405 nm mikro-ışınlama SSBR veya BER izlenmesi için uygun değildir ve DNA’ın birden çok işaretleri adducts ve sonları strand indüklenen lezyonlar ve DNA onarım yanıt-e doğru tam olarak karakterize etmek için istihdam edilmelidir gösteriyor. İşe Alım ve muhafaza edilmesine XRCC1 GFP doz bağımlı değişiklikBir kez indüklenen DNA hasarı ile karakterize, lazer mikro-ile DNA onarım proteinler dinamikleri eğitim için ideal bir platform olabilir. XRCC1 GFP tutma ve ayrılma Kinetik tarafından her dalga boyu farklı hasar karışımları indüksiyon verilen beklenmedik değildir doz bağımlılık (şekil 1) gösterir. En yüksek ışınlama doz (10 s ve 0.5 fps) XRCC1-GFP daha düşük dozlarda göre daha yüksek bir yoğunluk alımı ve hasar yerinde XRCC1 GFP uzun tutma 20 dk zaman boyunca (şekil 1C) gösterir. Bu görünüm ve saklama DSB işaretleri, γH2AX ve 53BP-1 ile tutarlıdır deneme seyri sırasında çözülemeyen 355 ve 405 nm için yüksek dozda oluşturulan DNA hasarı olasılığı olduğunu gösterir (şekil 3 & 4 ). İlginçtir, daha düşük hasar dozlarda (2 s ve 8 fps) XRCC1-GFP hasar sitelere hızlı alımı ve XRCC1 GFP ayrılma öncesi ışınlama düzeyleri (şekil 1C) deneysel saat boyunca gösterir. Hasar karışımı tam karakterizasyonu, bu SSBs ve temel lezyonlar tamamen bu zararlı koşullar kullanarak çözülebilecek olan bu sonuca neden olabilir. Ancak, γH2AX ve 53BP-1 40 dk için 355 nm ve 5 min için 405 nm farklı yorumlara neden olabilir. 355 nm 2 s doz için 40 dk DSB işaretleri görünümünü Düzeltilmemiş bazı lezyonlar DSBs için lider veya bu enerji tarafından oluşturulan DSBs daha uzun bir zaman ölçeği üzerinde onarılır gösteriyor olabilir bu yüzden hasar karışımı SSBs, ağırlıklı olarak olabilir. Zaman ölçeği farklılıklar arasında SSBR ve DSB onarım daha önce raporlanmış28,41,42olmuştur. Benzer şekilde, 405 nm düşük doz (8 fps) ayrılma SSBs düşük düzeyde gösterebilir veya bir hızla DSBs için dönüştürülür SSBs, hangi kaydetti için yüksek kümeleme ajanlar zararlı mikro-ışınlama ve diğer DNA hasar daha önce43, 44 , 45. Birlikte bu sonuçlar indüklenen zarar karışımları karakterize önemini vurgulamak ve kullanan birden çok DNA onarım proteinler ve işe alma ve saklama DNA’ın yorumlamak için işaretleri proteinler sitelerde indüklenen zarar onarım. Resim 1 . Lazer mikro-ile XRCC1 GFP alımı neden olmaktadır. (A) CHO-K1 hücreleri stabil XRCC1 GFP ifade ışınlanmış ve önce ve hemen sonra hasar indüksiyon görüntüsü. Oklar, mikro-ışınlama doz konumunu gösterir ve ölçek çubuğu var. 10 µm (B) işe alım ortalama floresan yoğunluğu içinde hasar ROI belirlenmesi ve tüm çekirdeği floresan ortalama yoğunluğu normalleştirme tarafından ölçülür. (C) işe alım dinamiklerini her timelapse görüntü için ölçülebilir. Grafikler ile SEM temsil eden hata çubukları iki bağımsız deneyler temsilcisi vardır (n = 24). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 . Lazer mikro-ile nükleotit hasar neden olmaktadır. CHO-K1 hücreleri mikro-ışınlama lazer tabi ve hemen sonra hasar indüksiyon sabit. Ayirt CPD algılamak için gerçekleştirilmiş ve 8-oxodG adducts. (A) top, dağılım çizim yoğunluklarda gözlenen yatırım Getirisi ortalama Floresans in CPD boyama sonra hücreler zarar görmüş. Alt, CPD boyama temsilcisi görüntüler. Oklar, mikro-ışınlama konumunu gösterir ve ölçek bar 10 µm (n = 12). (B) 8-oxodG boyama için temsilcisi görüntüler. Oklarmikro-ışınlama konumunu belirtmek ve ölçek çubuğu 10 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 . DNA Çift Kişilik strand sonu işaretçileri 355 nm mikro-ışınlama için bir doz bağımlı şekilde yanıt. CHO-K1 hücreleri mikro-ışınlama için tabi ve zaman Puan belirtilen sonrası uyarımı de sabit. Ayirt DSB işaretleri γH2AX ve 53BP-1 için gerçekleştirildi. (A) YG demek ölçülen Floresans yoğunluklarda hasarsız ve hasarlı hücreleri için normalleştirilmiş hasar Çizim dağılım. Hata çubukları çoğu SEM temsilcisi (n = 12). (B) γH2AX ve 53BP-1 boyama için temsilcisi görüntüler. Oklar, mikro-ışınlama konumunu gösterir ve ölçek çubuğu 10 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4. DNA Çift Kişilik strand sonu işaretçileri sağlam 405 nm mikro-ışınlama için yanıt.CHO-K1 hücreleri mikro-ışınlama için tabi ve zaman Puan belirtilen yazı uyarımı de sabit. Ayirt DSB işaretleri γH2AX ve 53BP-1. (A) YG demek ölçülen Floresans yoğunluklarda hasarsız ve hasarlı hücreleri için normalleştirilmiş hasar Çizim dağılım. Hata çubukları çoğu SEM temsilcisi (n = 12). (B) γH2AX ve 53BP-1 boyama için temsilcisi görüntüler. Oklar, mikro-ışınlama konumunu gösterir ve ölçek çubuğu 10 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Burada tanımlanan koşullara kullanarak, bir UV-A veya üretici tarafından entegre veya son kullanıcı tarafından eklenen 405 nm lazer, confocal herhangi bir mikroskopla DNA hasar bir hücre çekirdeği içinde ikna etmek ve DNA onarım proteinler sitesine alımı izin verebilirsiniz izlenecek DNA hasarı indüklenen. Ancak, belirtilen iletişim kuralı ve temsilcisi sonuçları, dalga boyu seçimi, güç, uygulanan ve hasar karakterizasyonu, ilk kullanıcı tarafından belirli bir DNA çalışması için ele alınması gereken sorunlar yolu tamir tüm önemli. Ayrıca, aynı zamanda kullanıcıların dikkate alınmalıdır deneysel tasarım ile ilgili diğer konular bulunmaktadır.

Protein davranış canlı hücreleri sonrası izlemek için mikro-ışınlama, fluorescently etiketli bir protein oluşturulması gerekir. Geniş bir hayalice ayrılmış floresan proteinlerin kullanılabilirliğini hücresel yanıt DNA hasarı indüksiyon için karakterize için kullanılabilir protein füzyon oluşturmak için araçlar sunar. Stabil transfected hücreleri sunarken daha ifade seviyeleri üzerine kontrol ve diğer biyokimyasal izin ilgi floresan proteinlerin geçici transfection zararlı koşullar, mutasyonlar veya hatta inhibitörleri, hızlı tarama için sağlar karakterizasyonu gerçekleştirilecek, mikro-ışınlama sonuçları doğrulanıyor. Hayalice farklı floresan proteinler de aynı hücrede protein aynı yolu içinde veya farklı yolları arasındaki etkileşimleri izlemek için yararlı olabilir. Floresan proteinler de ilgi her protein için özel antikorlar ihtiyacını ortadan kaldırmak ve canlı hücre hasarı indüksiyon sonra uzun süreler için protein davranışını izleme sağlar.

Ancak, floresan proteinler kullanımı da sakıncaları vardır. Genetik arka plan eksik faiz protein(s) içinde endojen proteinler fluorescently tagged proteinler ile yarışacak. Konjugasyon floresan etiketinin protein N ve C terminus için protein katlanması değiştirme, anahtar protein-protein etkileşimleri engel veya translocation sinyalleri engellemek; işlevini değiştirme ve potansiyel olarak işe alım dynamics etkileyen. Bu etkiler nerede immünfloresan boyama önemli ölçüde farklı işe alma ve saklama defa endojen proteinleri hasar site28için gösterilen raporlar bir dizi gösterilmiştir. Geçici transfection veya istikrarlı klonlar da gözlenen, genellikle protein ifade düzeyleri değişimler aracılığıyla yanıt değiştirebilirsiniz. Ayrıca, birden çok floresan proteinler arasında tek bir deneme kullanımı da işe alım, dinamikleri protein düzeyleri de equilibrated değil mi yoksa daha büyük fluorescently öğesini protein alımı diğer protein alımı engeller değişebilir . Son olarak, floresan proteinler Reaktif oksijen türleri oluşumu artan ve potansiyel olarak DNA hasarı karışımları indüklenen46,47değiştiren zayıf Sensitizasyonu aracıları olarak hareket edebilir. Bu sakıncaları rağmen floresan proteinler bir dizi farklı avantajlar eğitim DNA mikro-ışınlama ile onarım ve kullanıcılar burada, açıklanan zarar nitelemesi gibi uygun denetimler dahil onlar-ebilmek sağlamak yeni bir bakış açısı sunmak içine yanıt ve protein-protein etkileşimleri3zarar.

Canlı hücre görüntüleme gerekli değilse, ayirt indüklenen zarar yanıtı izlemek için kullanılabilir. Hücreleri belirli zamanlarda sabitleme tarafından hasar indüksiyon ve ile antikor protein ve lezyonlar faiz, hasar indüksiyon statik anlık görüntüleri ve işe alma ve saklama proteinler inşa edilebilir onarım için özel boyama sonrası. Antikorlar, faiz ve/veya translasyonel modifikasyonlar DNA hasarı yanıt tarafından indüklenen birden fazla protein alımı izlemek için kullanılabilir. Ayirt kullanımı floresan protein gereksinimini ortadan kaldırır ve endojen protein davranış incelenmesine izin verir. Ancak, bu yöntem çok sakıncaları vardır. Çok özel antikorlar gereklidir ve permeabilization ve engelleme yordamlar işe alım tespiti için yeterli sinyal yoğunluğu ile izin için optimize edilmiş olması gerekir. Sabitleme yordamlar anlık değildir ve bu fiziksel sınırlama bu yaklaşımın zamansal çözünürlük sınırlar. Hücre boyama sonra yeniden bulunduğu böylece hasar indüksiyon site eşleme önemli sorunlar da mevcut. Hasarlı hücreleri yüksek hassasiyetle taşındı nedenle bu çalışmada kullanılan confocal mikroskop yansıma tabanlı kayıt için yukarıda açıklandığı gibi sağlar. Sahne kayıt veya kabartma coverglass yatırım dahil zaman, yoksa taşındıktan hücreleri hasar indüksiyon ve görüntülü işe alım arasındaki doğal gecikme ile birleştiğinde sahne kayıt olmadan ayirt yapabilir bazı kullanıcılar için itici. Ancak, en doğru ve eksiksiz mikro-ışınlama deneysel tasarımlar bu tür yaklaşımlar paralel floresan proteinler, kullanımı ile sunulan protokolünde açıklandığı gibi dahil edecektir.

Burada, canlı hücre görüntüleme ve ayirt lazer mikro-ile yardımcı programı göstermek için kullanılır. İmmünfloresan boyama doğru bir şekilde oluşturulan DNA hasarı karışımı incelemek için bize izin verir ve bize daha iyi izin her lazer güç tarafından indüklenen protein alımı yorumlamak işe alım ve muhafaza edilmesine XRCC1 GFP gözlenen değişiklikler. Bu sonuçlara dayanarak, 405 nm lazer kullanımı BER ve SSBR proteinlerinin incelenmesi için sınırlı olmalıdır. Ayrıca, en iyi deneysel tasarım amacı, tam hasar karışımı karakterizasyonu için kullanılan her hücre kültürünü ve işe alım doğrulanmasını sonra güç ölçümleri yer alacağını ve saklama fluorescently gözlenen proteinler ile etiketlendi ayirt. Belli ki, ekipman, zaman ve maliyet dikkat edilmesi gereken noktalar bu en iyi deneysel tasarımlar imkansız bazı kullanıcılar için yapabilir. Ancak, bu öğelerin her birini önemini aşağıda gösterildiği ve kullanıcılar bunu göz önünde mikro-ışınlama deneylerin başlangıcında tutmalı.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Dr Samuel H. Wilson, ulusal çevre sağlık Bilimler Enstitüsü Bu çalışmada kullanılan hücre hatları için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope Nikon
NIS Elements software Nikon
355 nm laser PicoQuant VisUV Radiation source
Galvanometer photoactivation miniscanner Bruker
Microscope slide photodiode power sensor THORLabs S170C
Fiber photodiode power sensor THORLabs S150C
Digital handheld optical power and energy meter THORLabs PM100D
CHO-K1 From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Minimal essential media Hyclone SH3026501
Fetal bovine serum Atlanta biologicals S11550
XRCC1-GFP Origene RG204952
Jetprime Polyplus transfection 11407
Geneticin ThermoFisher 10131035
4 chambered coverglass ThermoFisher 155382
8 chambered coverglass ThermoFisher 155409
Anti 53BP-1 Novus NB100304
Anti-phospho-histone H2AX  Millipore 05-636-I
Anti cyclobutane pyrimidine dimer Cosmo Bio clone CAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine  Trevigen 4354-MC-050
Alexa 488 goat anti-mouse ThermoFisher A11029
Alexa 546 goat anti-rabbit ThermoFisher A11010
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher R37606 Caution toxic!
Phosphate buffered saline ThermoFisher 0780
Normal goat serum ThermoFisher 31873
Bovine serum albumin (BSA) Jackson Immuno Research 001-000-162
37% Formaldehyde ThermoFisher 9311 Caution toxic!
Ethanol Decon Labs 2716
Methanol VWR BDH1135 Caution toxic!
HCl Fisher SA49
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Caution toxic!
Tris Hydrochloride Amresco O234
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
  2. Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
  3. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  4. Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
  5. Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser–UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
  6. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, 71-75 (2003).
  7. Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
  8. Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
  9. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68 (2009).
  10. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  11. Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
  12. Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
  13. Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
  14. Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
  15. Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
  16. Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
  17. Stelzer, E. H. K., Haar, F. -. M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
  18. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
  19. Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
  20. Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301 (2012).
  21. Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
  22. Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
  23. Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
  24. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  25. Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
  26. Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
  27. Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
  28. Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
  29. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
  30. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  31. Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, 4153-4162 (2005).
  32. Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
  33. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
  34. London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
  35. Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
  36. Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
  37. Cooke, M. S., Lunec, J. . Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , 275-293 (2003).
  38. Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
  39. Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
  40. Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
  41. Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
  42. Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
  43. Lomax, M. E., Gulston, M. K., O’Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
  44. Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059 (2011).
  45. Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
  46. Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation–towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, 1621-1629 (2014).
  47. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).

Tags

Laser Micro-irradiationDNA DamageDNA RepairSingle And Double Strand BreaksProtein RecruitmentReal-time VisualizationFluorescent MicroscopyAutomated Microscope StageFocal PlaneRegion Of Interest (ROI)405-nanometer Laser

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (127), e56265, doi:10.3791/56265 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image