Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse
Summary
Os ratos são amplamente utilizados para estudar Biologia gestacional. No entanto, a terminação de gravidez é necessária para tais estudos, que se opõe a investigações longitudinais e exige o uso de um grande número de animais. Portanto, descrevemos uma técnica não-invasiva da ultra-sonografia de alta frequência para a deteção adiantada e monitoramento de eventos após a implantação no mouse grávido.
Abstract
Ultra-sonografia de alta frequência (HFUS) é um método comum de forma não-invasiva, monitorar em tempo real desenvolvimento do feto humano no útero. O mouse é usado rotineiramente como um modelo in vivo para estudar a implantação do embrião e progressão da gravidez. Infelizmente, tais estudos murino exigem a interrupção da gravidez para permitir o acompanhamento análise fenotípica. Para resolver esse problema, usamos a reconstrução tridimensional (3D), de HFUS imagens, para a detecção precoce e caracterização de locais de implantação do embrião murino e sua progressão no desenvolvimento individual no utero. Combinando HFUS imagem com reconstrução 3D e modelagem, fomos capazes de precisão quantificar o número de local de implantação de embriões, bem como monitorar a progressão do desenvolvimento em ratos grávidas C57BL6J/129S de 5,5 dias pós coito (d.p.c) através de 9,5 d.p.c com o uso de um transdutor. Medições incluídas: número, localização e volume de locais de implantação, bem como espaçamento inter implantação local; viabilidade do embrião foi avaliada pelo monitoramento da atividade cardíaca. O período pós-implantação imediato (5,5 a 8,5 d.p.c), reconstrução 3D do útero gravid em malha e sobreposição sólida formato habilitado uma representação visual das gravidezes em desenvolvimento dentro de cada corno uterino. Como os ratos geneticamente modificados continuam a ser usados para caracterizar fenótipos reprodutivos femininos, derivados de disfunção uterina, este método oferece uma nova abordagem para detectar, quantificar e caracterizar mais cedo implantação eventos na vivo. Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. Aqui usamos um formato de vídeo e texto para descrever como executar com sucesso ultra-sonografias de gravidez precoce de murino para gerar dados confiáveis e reprodutíveis, com reconstrução da forma uterina em malha e imagens 3D sólidas.
Introduction
Perda de gravidez precoce recorrente é uma das complicações mais comuns após a concepção e afeta aproximadamente 1% dos casais que tentam engravidar1,2. Os mecanismos subjacentes de perda de gravidez precoce são variados: de anormalidades embrionárias intrínsecas e comorbidades maternas para defeitos na receptividade endometrial1,3,4. Por causa de sua rastreabilidade genética, modelos do rato têm sido amplamente utilizados para investigações de implantação do embrião precoce e gravidez. Além disso, o curto tempo gestacional de mouse e a capacidade de realizar estudos em grande escala têm garantido o utilitário crescente do rato em abordar questões-chave clínicos em medicina reprodutiva humana5. Dito isto, a grande maioria dos projetos experimentais murino exige ainda numerosas barragens para ser sacrificado em dias gestacional sequenciais para quantificar e analisar os padrões de espaçamento, número, tamanho e localização do local de implantação durante a gravidez6, 7,8, impedindo, assim, estudos longitudinais do mesmo animal.
Na clínica, o ultra-som é uma ferramenta confiável e de valor inestimável para monitorar viabilidade fetal humana e desenvolvimento em uma forma não-invasiva9,10,11. Mais recentemente, ultra-som de alta frequência (HFUS) começou a encontrar aplicações limitadas no mouse, como um método para monitoramento da viabilidade fetal e crescimento durante gravidez12,13,14. Os recentes avanços tecnológicos em ultra-sonografia permitiram a aplicação de dados (3D) tridimensionais para reconstrução visual de órgãos animais e posterior acompanhamento de patologias15,16, 17. Utilização desta tecnologia de imagem avançada melhorou acentuadamente o poder de detectar flutuações de menor volume, para reduzir a variabilidade de animal para animal e para monitorar a progressão de uma patologia ou a eficácia de uma intervenção terapêutica17. Enquanto o utilitário principal desta tecnologia tem sido monitorar a progressão da malignidade em oncomouse modelos15,16, imagens 3D de HFUS só recentemente tem sido usada para quantificar e monitorar o crescimento ativo de implantação do embrião e desenvolvimento do feto no útero rato18.
Aqui, vamos demonstrar como executar HFUS imagem para produzir dados 2D e 3D para gerar reconstruções do útero rato grávida cedo. Vamos demonstrar a utilidade desse romance método para detectar esses eventos de implantação embrionária precoce sem a necessidade de cessação da gravidez, permitindo que os pesquisadores coletar dados de forma não-invasiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. No entanto deve notar-se que métodos histológicos ainda seria considerados mais ideais quando caracterização em um nível mais ampliada e mais cel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos muito a ajuda de Rong Zhao Jie Li e Yan Ying.
Materials
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
References
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
- Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
- Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
- Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
- Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897 (2015).
- Ding, Y. B., et al. 5-aza-2′-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364 (2012).
- Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
- Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
- Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
- Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38 (2014).
- Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
- Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97 (2015).
- Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
- Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
- Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312 (2017).
- Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for ‘on-time’ embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
- Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500 (2012).
- Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171 (2016).
- Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
- Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
- Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
- Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).
