JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Génétique

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/56195
,
1Gene Editing Institute, Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute,Christiana Care Health Services, 2Department of Medical Sciences,University of Delaware

Summary

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Abstract

Kombinatorik gen CRISPR/Cas9 ve tek iplikçikli oligonucleotides kullanarak düzenleme kez insan kalıtsal bozukluklar çeşitli için sorumlu olan tek-temel noktası mutasyonlar düzeltilmesi için etkili bir stratejidir. Köklü hücre tabanlı model sistem kullanarak, nokta mutasyon HCT116 hücre içine entegre bir tek kopya mutant eGFP gen bu Kombinatorik yaklaşım kullanılarak onarıldı. İndels hedef site çevreleyen DNA dizisi düzeltilmeyen hücrelerde oluşturulduğunda düzeltilmiş ve düzeltilmeyen hücre analizi genetik bozuklukları, geliştirilmesi ve gen düzenleme hassas ortaya koymaktadır. Burada, belirli metodoloji Indel oluşumu, hedef sitede ölçme için detaylı bir deneysel strateji ile birleştiğinde bir nokta mutasyon gen düzenleme bu Kombinatorik yaklaşım çözümlemek için kullanılan gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı bir temel yaklaşım ve CRISPR/Cas9-tabanlı gen insan tedavisi için düzenleme geliştirmeyi amaçlayan araştırmalar için iş akışı özetliyor. Bu iş yerinde o mutagenesis CRISPR/Cas9 aktivite sonucunda nokta mutasyon onarım işlemi sırasında gerçekleşir çıkarımıdır. Bu eser klinik uygulama için mukadder herhangi bir yaklaşım önemli ve kritik bir yönünü olmalıdır mutagenesis derecesini tanımlamak için standart bir metodoloji yere yerleştirir.

Introduction

Mandecki (1986) tarafından çalışmalar öncü bakteri1, Walder ise haline dönüştürdü oligonucleotides ve Maya2benzer çalışmalar yürüttü Walder (1986) kullanarak plazmid DNA’kalıcı değişiklikler gösterdi. Kısa bir süre sonra Sherman ve meslektaşları tek iplikçikli oligonucleotides genler3kalıtsal değişiklikler yapmak Maya hücreleri içine kullanılmaya başlanan kağıtları bir dizi yayınlandı. Mikrobiyal hücrelerde seminal iş oluşturan, Kmiec ve meslektaşları tek temel onarım memeli hücreleri4‘ te yönettiği benzersiz tek ajan oligonucleotides geliştirmeye başladı. Bu kavram taşıyan RNA molekülleri daha sıkı bu tamamen DNA üsleri oluşan daha hedef siteye bağlamak gösterdi biyokimyasal veri dayanıyordu. Gen düzenleme başarı chimeric oligonucleotides5,6,7kullanarak çok sayıda rapor olmasına rağmen düzeylerini düzenleyerek son derece değişken farklı hedef/hücre ve deneylerde arasında kaldı kombinasyonları.

Rasgele genom8sitelerle tümleştirmek daha az olasıdır çünkü tek iplikçikli donör DNA çift iplikçikli donör DNA için tercih edilir. Ancak, exogenously tanıttı tek iplikçikli oligonucleotides hızlı yıkımı hücresel enzimler tarafından yatkındır. Oligonucleotides termini bozulması korumak için çeşitli stratejiler istihdam edilmiştir. İstenen sırayı içeren bir eksonükleaz korumalı, tek iplikçikli DNA 0.1-1 bir düzenleme verimliliği elde etmek için yeterli % aralığı6. Geliştirilmiş ve fenotipik çıktıları ile birleştiğinde daha tutarlı transfection teknikleri için izin verilen birden çok araştırma grupları8,9,10,11tarafındandüzenleme daha tutarlı, 12,13.

Son 10 yılda hedef hücrelerin gen düzenlemeye daha uysal yapmak için önemli bir çaba olmuştur. Bir stratejisi hücre döngüsü14,15,16modülasyon istihdam. Frekansları tek iplikçikli oligonucleotides (ssODNs) ile normal reaksiyon koşulları altında düzenleme girmiştir iken süpürdü kültürlü memeli hücreleri % 0,1 ile % 1, artan 3 – için 5 – kat zaman düzenleme gen frekansları arasında oligonucleotides hücrelere kendi geçiş S aşaması sırasında tanıtıldı. Ne zaman 2’3 ‘ dideoxycytosine (ddC) 24 saat önce Oligonükleotid17 eklenmesi için hücrelerindeki inkübe kesin gen (% 3-5) düzenleme nispeten yüksek düzeyde elde edilmiştir Brachman ve Kmiec (2005) deneyler ayrı bir dizi içinde gösterdi . ddC DNA çoğaltma çatal hareketi, hücreleri olası çoğaltma içinde ssODNs tarafından gen düzenleme ODNs birleşme bölgeleri etkin çoğaltma11,18içerdiğini öne oranını azaltır. Birlikte, donör DNA gen düzenleme, gerçek mekanizmaları bir parçası olarak büyüyen bir çoğaltma çatal dahil olur kavramı yol açtı bu çalışmalar bir çift iplikçikli ara bulunup bulunmadığını veya değil19bağımsız ele alındığında. Böylece, bir nokta mutasyon düzeltilmesi veya Kromozom DNA segmentte değiştirme bir DNA çift ve tek iplikçikli asimilasyon yolu ile oluşur.

Rasgele çift iplikçikli DNA sonları hücreleri küçük molekül ajanlar ile büyüyen inducing hücre hasarı20,21onarmaya çalışır hangi DNA çoğaltma olayları geciktirilmiş bir ortam oluşturur. Bu geçici yavaşlama çoğaltma çatal tek iplikçikli düzenleme oligonucleotides hedef erişilebilirlik15iyileştirilmesi tarafından Kromatin yapısının daha verimli bir nüfuz sağlar. VP16, bleomycin, gibi ilaçlar tarafından çift iplikçikli DNA oluşturulması tatili veya camptothecin22,23, gen düzeyleri tarafından yaklaşık 10 kat, düzenleme uyarmak için gösterilen % 6-8’e kadar. Ancak, rastgele çift iplikçikli DNA sonları tedavi edici bir ortamda istenmeyen.

Programlanabilir nükleaz ve oligonucleotides ile düzenleme Gene de hücre bölünmesi24,25sırasında. uyarılmış Nükleik asit alan teslim eşitlenmiş HCT 116 hücrelerdeki onarım homoloji yönetmen gerçekleştirmek için kullanıldığında, Rivera-Torres ve meslektaşları etkinlik hedefleme aynı artış gösterdi zaman transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs) tek iplikçikli oligonucleotides, hem bir çoğaltma hücre nüfus26,27 tanıttı ile istihdam edildi. Daha yakın zamanlarda, Bialk ve meslektaşları ile tek iplikçikli oligonucleotides tek temel mutasyonlar tamiri ve bir dizi düzenli olarak interspaced kısa palindromik tekrarlar Cas9 kümelenmiş gösterdi ile yüksek etkinlik yer (CRISPR/Cas9) molekülleri alır Ne zaman hücre popülasyon S faz28geçme. CRISPR molekül RNA ve işlevleri bölünme için belirlenmiş DNA dizisi hedef bölgede tanımlamak için oluşur. Cas9 fonksiyonu çift iplikçikli DNA bir nucleolytic Satım reaksiyon ayırmak etmektir bakteriyel bir enzimdir. Böylece, CRISPR karmaşık genomik hedefte konumlandırır ve Cas9 nükleaz çift iplikçikli sonu yürütür. Lin vd. (2014) de yüksek frekanslarda gen ulaşmak için hücre döngüsü önemini gösterdi, birincil yenidoğan fibroblastlar, insan embriyonik kök hücreleri, değiştirilmiş CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) karmaşık aracılı iletim sistemi kullanarak düzenleme ve diğer hücre hatları24. Böylece, gen düzenleme ve tek ajan gen düzenlemek için hücre döngüsü ilerleme arasında kurulan ilişki Kombinatorik gen programlanabilir nükleaz ve donör DNA şablonları kullanarak düzenleme için geçerlidir. Gen düzenleme Kombinatorik yaklaşım ortakları donör DNA şablonu ile çeşitli buluşturuyor, alanında en işçiler çift iplikçikli ara fonksiyonu sağlamak için CRISPR/Cas9 kullanın. Bu seçim rahatlık–in-kullanma bu belirli genetik araç ve hangi ile bu gen işlevini devre dışı bırakmak için ya da yabancı bir DNA parçası belirli bir siteye tanıtmak için istihdam edilebilir esneklik üzerine esas olan. Bir nakavt nesil teknik olarak daha kolay nerede “doğru” ya da normal bir gen kopyalarını birleşme hastalığı siteye hassasiyetle yapılmalıdır bir gen yerine, karşılaştırılır. Araştırmacılar bir dizi tanımlama ve belirli ilaçlar ve mutant üsleri düzeltilmesi ve yüksek Frekanslar29uygun pozisyonda normal genetik sıralarının ekleme etkinleştirmek Kimyasalları kullanımı eğitimi.

Son zamanlarda, Rivera-Torres vd. kullanılan 30 Kombinatorik gen düzenleme, çift iplikçikli mola faaliyeti özel tasarlanmış bir CRISPR/Cas9 sistemi ve onarmak için bir tek iplikçikli Oligonükleotid donör DNA şablon tarafından sağlanan genetik bilgi yararlanarak bir nokta mutasyonu birGelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) genin tek kopya HCT116 hücre içine entegre. Yazarlar hedef site çevreleyen bölünme özgüllük değerlendirmek için bu iyi karakterize modeli hücre satırı kullandı. Veriler heterojenite hedef sitesinde var, özellikle düzeltilmiş bir nokta mutasyon içeren hücrelerde ortaya koymaktadır. Bu makale içinde detay ve odak bu işçiler tarafından yerinde mutational heterojenite gen CRISPR/Cas9 düzenleyerek oluşturulan incelemek için kullanılan metodoloji üzerine.

Protocol

Aşağıdaki protokol memeli hücreleri ile çalışma gerektirir; steril tekniği/hücre kültürü ile aşinalık bekleniyor. 1. hücre kültürünü ve kültür koşulları yapmak 500 mL orta HCT 116 hücre kültürü için: McCoy ' s 5A değiştiren % 10 fetal sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin ve (Bu tam %1 penisilin ile desteklenmiş orta Orta). Not: HCT kaplama önce bir T-75 veya T-175 şişesi 116-19 hücreleri büyümek. Ne zaman % 90 birleşmesi, her T-75 şişeye 10 6 hücreler, kabaca beş 10 cm tabak, x 8,4 verecek ve her T-175 10 6 hücreler, kabaca on beş 10 cm tabak x 18,4 verecektir. 2. Şişeye hücrelerden hasat uzak orta Aspire edin, yıkama ile Dulbecco ' lar Phosphate-Buffered serum kalsiyum ve magniesium (PBS) (10 mL T-75 veya T-175 için 25 mL) ve Aspire edin. Ekle tripsin 2 mL pipet (2 mL için T-175 veya T-75 için 1 mL) kullanarak şişesi dropwise. 37 ° C ve % 5 CO 2 ayırmak hücreleri izin vermek 5 min için bir kuluçka şişeye koyun. Emin olmak için tüm hücreleri yerinden ve sonra şişeye (8 mL T-175 veya 4 mL T-75) tüm yüzey üzerinde dağıtıcı maddeler tarafından tam orta ile gidermek şişeye dokunun. Pipet yukarı ve aşağı hücre kümeleri kırmak ve bir 15 mL konik tüp hücrelere aktarmak için birden çok kez Hücreleri iplik önce aşağı, 15-mL konik üzerinden 10 µL almak ve trypan hücreleri saymak için mavi 10 µL ile birleştirmek. 125 g x ve 16 5 min için iplik tarafından hücreleri cips ° C. 3. Hücreleri sayma Transfer 10 µL hücrelerin trypan hemasitometre için mavi ile karışık. (Her bir kılavuz görüntüler 16 kareler) dışında etrafında 4 ızgaraları saymak. Ortalama hücre sayısı on altı köşe kareler her dizi alın. 10.000 tarafından çarpın (10 4). Trypan mavi ek dan seyreltme için düzeltmek için hücre hasat için kullanılan orta hacmi çarpmak. Not: Cilt hücreleri resuspend hesaplamak için denklem biçimi izler: 4. Hücreleri kaplama 5 mL tam orta ve aphidicholin (200-proof etanol içinde 2.5 mM stokunun 12 µL) 6 µM için her 10 cm tabak eşitlenmesi hücrelerin ekleyin. Transfer 100 µL yeniden askıya alınan hücrenin cips, 2. 5 x 10 6 hücreler, her 10 cm tabak ve girdap karışımı yavaşça. 16-24 h hücre G1/S sınır eşitlemek için 37 ° C ve % 5 CO 2 tabak kuluçkaya. 5. Aphidicolin eşitleme hücrelerden serbest hedefleme önce 4 h orta Aspire edin, PBS ile yıkayın, PBS Aspire edin ve tam orta 5 mL ekleyin 37 ° C ve % 5 CO 2 4 h için kuluçka geri yerleştirin 6. RNA kompleks Enter mutant eGFP Gen dizisi Zhang laboratuarına ' s online jeneratör 25 (http:// crispr.mit.edu/) ve CRISPR Kılavuzu yakınlığı hedef site ile bağlamak serileri seçin. CRISPR Kılavuzu dizileri ticari bir kaynaktan elde edilir. CRISPR RNA (crRNA), crRNA (tracrRNA) trans etkinleştirme ve Cas9 protein 20 ° C’de depolayın ve üretici öneriler göre kullanın. İçin 45 µM. eklemek 6,75 µL ekimolar konsantrasyonları crRNA 200 µM stokunun ve tracrRNA 1.5 mL santrifüj için 200 µM stokunun 6.75 µL RNA karışımda tüp. TE son hacmi 30 µL yapmak için arabelleği 16.50 µL ekleyin. Isı ısı blok veya PCR makinesi 5 min için 95 ° C’de. Dikkat: Sıcak! İzin ver oda sıcaklığında soğumaya. Not: bir PCR makinesi kullanıyorsanız, 0.2 ° C’ye soğutma set/s. , Her örnek için aşağıdaki adımları uygulayın. CrRNA:tracrRNA TE arabellek (10 mM Tris, pH 8.0 ve 0,1 mM EDTA; pH 8.0) 2.78 µL 5 µL son hacmiyle karmaşık seyreltik 2.22 µL. Cas9 Protein son 5 µL hacmiyle seyreltik 1.67 µL 3.33 µL düşük serum orta bir 60 µM stoktan. Mix 5 µL Cas9 protein complexed RNA’ın 5 µL ile 7. Hücreleri hedefleme için hasat aspiratı orta, PBS, 5 mL ile yıkama PBS Aspire edin ve Önceden ısıtılmış tripsin 1 mL her 10 cm plakasına ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO 2 kuluçka 5 dakika süreyle plakaları koymak Dokunun tüm hücreleri yerinden ve sonra plaka tüm yüzey üzerinde dağıtıcı maddeler tarafından tam orta 4 mL ile gidermek emin olmak için 10 cm tabak. Yukarı ve aşağı hücre kümeleri kadar kırmak ve hücreleri 15 mL konik tüp aktarmak için birden çok kez pipet. Hücreleri iplik önce aşağı, 10 µL 15 mL konik tüp almak ve trypan hücreleri saymak için mavi 10 µL ile birleştirmek. İplik, 125 x g ve oda sıcaklığında 5 min için tarafından hücreleri cips. Orta Aspire edin ve PBS ile 5 mL yıkayın. 125 x g oda sıcaklığında 5 min için de iplik tarafından hücreleri cips. 8. Hücreleri sayma Transfer 10 µL hücrelerin trypan hemasitometre için mavi ile karışık. (On altı kareler her bir kılavuz görüntüler) dışında etrafında 4 ızgaraları saymak. Ortalama hücre sayısı on altı köşe kareler her dizi alın. 10.000 tarafından çarpın (10 4). Trypan mavi ek dan seyreltme için düzeltmek için hücre hasat için kullanılan orta hacmi çarpmak. Not: Cilt hücreleri resuspend hesaplamak için denklem biçimi aşağıdadır. Serum-Alerjik McCoy hücrelerde gerekli sayıda yeniden askıya ' s 5A değiştiren orta. 9. örnekleri hedefleme 100 Aktarım Her adım 4-mm boşluk küvet için hücre süspansiyon (5 x 10 5 hücreleri) adım 8.1 µL. RNP karmaşık 10 µL adım 6,7-100 µL 5 x 10 5 hücre yoğunluğu, hücrelerin ekleyin. ODN ekleyin (2 µM) her örnek için. Not: Olumlu bir denetim için eGFP 1 µg/µL plazmid ifade, 1 µL elektroporasyon makineye raf almak ekleyin, hafifçe her örnek fiske ve odasında yer onları. Electroporate 250 V, LV; 2 bakliyat, 1 s; 13 ms; tek kutuplu darbe. Rafa geri hood için transfer. Her örnek için bir de içeren 2 mL tam orta aktarım benn 6-şey plaka. Düzeltme düzeyleri için denetlemeden önce 37 ° C ve % 5 CO 2 72 h için kuluçkaya. 10. Gene düzenlenmiş hücreler ve Transfection verimlilik analizi Orta Aspire edin ve PBS 2 mL hücrelerle yıkayın. PBS Aspire edin ve Önceden ısıtılmış tripsin 500 µL 6-şey plaka her şey için ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO 2 kuluçka 5 dakika süreyle plakaları koymak Emin olun tüm hücreleri yerinden ve o zaman iyi tüm yüzey üzerinde dağıtıcı maddeler tarafından tam orta 1 mL ile gidermek için plaka dokunun. Hücreleri içine 1.5 mL santrifüj tüpü ve Pelet 5000 x g oda sıcaklığında 5 min için de geçmek. Orta Aspire edin. Hücre Pelet FACS arabelleği (% 0.5 BSA, 2 mM EDTA ve 2 µg/mL propidium iyodür PBS) 500 µL yeniden askıya. Hücre floresan (eGFP +) Akış Sitometresi tarafından ölçmek. Rivera Torres ve ark 30 ‘ açıklandığı gibi her örneğinde, canlı hücrelerin toplam sayısı üzerinden canlı eGFP pozitif hücrelerinin toplam yüzdesi olarak düzeltme verimlilik hesaplamak. 11. DNA dizi analizi Electroporate eşitlenmiş ve yayımlanan HCT 116-19 hücreleri, 5 x 10 5 konsantrasyon   hücreler/100   µL RNP 100 pmols ve 72NT karmaşık ile 2.0 µM, ODN. 6-iyi plakaları hücrelere transfer ve onları için 72 h. kurtarmak izin Sıralama hücreleri tek tek FACS sıralayıcısı için eGFP +/-, 488-nm (100 mw) lazer ile kullanarak 96-şey tabak içine Rivera-Torres ve ark 30 ‘ açıklandığı gibi. Not: Tüm wells başarılı bir şekilde büyüyecek. Hücreleri üzerinde 6 hafta genişletin ve hasat 7. adımda açıklandığı gibi. (Tablo reçetesi görmek) büyüme var, piyasada bulunan bir DNA yalıtım kullanarak hücresel gDNA izole kuyuları kiti ve PCR ile temel hedef çevreleyen bölge yükseltmek (718 bp; ileri astar 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' ve ters astar 5 ' – ACTTGTACAGCTCGTCCATGC – 3 '). Gerçekleştirmek DNA örnekleri sıralama analizine.

Representative Results

Biz bir model sistem tek bir kopya HCT116 hücreleri olarak entegre eGFP gen içinde gömülü bir nokta mutasyon düzeltilmesi üzerine dayanır gen memeli hücrelerinde düzenleme çalışırdım. Bu tek kopya gen olduğunu unutmamak gerekir; Böylece, DNA değişiklikler veya mutagenesis daha az karmaşık bir görünümünü yapılabilir. Şekil 1A mutant eGFP Gen dizisi hedeflenen Bankası kodonu etiket kırmızı renkte, üçüncü tabanı ile görüntüler. Kısmen (72NT) eGFP gen transkripsiyonu strand tamamlayıcı ve bir g Bankası değişim bir c için tasarlanmış, 72-base Oligonükleotid da gösterilmiştir. Buna ek olarak, 2 C, ile belirtilen protospacer sırayla bir 5′ 3′, yönüne olarak belirlenmiş bir CRISPR da şekil 1A’ tasvir edilir. Bu gen düzenleme reaksiyon taşımak için biz (cr) RNA ve saf Cas9 protein (şekil 1B) birleştiğinde tracr (tr) RNA CRISPR oluşan bir Ribonükleoprotein (RNP) Cas9 gen oluşan bir memeli ifade vektör kullanmak yerine kullanılan ve uygun belirli Kılavuzu RNA dizisi. Özel tasarlanmış RNP parçacık HCT116 hücrelere çoğalmasıyla, düzenleme, gen tek iplikçikli Oligonükleotid ile teslim edildiğinde eGFP tek temel mutasyon tamiri kanıtladığı, bir akış kullanarak kuluçka 72 h sonra gözlenen sitometresi. Fonksiyonel onarım observable tarafından hedeflenen hücrelere, bu floresan nedeniyle sıralayarak tüm nüfusu da ayrılması hücreleri yeşil Floresans ortaya çıkması olduğunu. Şekil 2′ de gösterildiği gibi yavaş yavaş doz yanıt RNP ve 72NT artış koordine düzeyleri olarak görülebilir. Moleküler oranı, RNP picomoles ve bu şekilde, görüntülendiği gibi 72NT micromolar konsantrasyonu en uygun dozlarda Cas9 ve belirli Kılavuzu RNA transfected ifadeden giriş bağlı gen düzenleme reaksiyonlarda kullanılan temel alır vektörel çizimler. Şekil 2 ‘ deki ilave RNP parçacık yokluğunda yapılan bir gen düzenleme tepki görüntüler. Burada, 72NT Oligonükleotid 10 kat daha yüksek konsantrasyon tek ajan gen düzenleme tepki olarak kullanıldığında hedef hücreleri yaklaşık % 1’i düzeltilir. Genetik heterojenite hedef site sözde yerinde mutagenesis etkisi olup olmadığını belirlemek için-gen tek tek hücreleri içinde etkinlik düzenleme sonucu incelemeye karar verdik. Süre clonally genişletilmiş hücre genomu incelendiğinde genel nüfus, genetik ayak izleri veya lezyonlar doğru bir ölçü inceleyerek tespit edilebilir çok daha zahmetli. Şekil 2′ de, bu kez sadece RNP karmaşık 100 pmol ve 72NT Oligonükleotid 2.0 µmol kullanarak açıklanan deney tekrarladı. Olarak yukarıda, HCT 116 hücreleri için 24 h aphidicholine ile senkronize ve G1/S sınırda tutuklandı. 4 h daha sonra hücreleri serbest bırakıldı ve gen düzenleme araçları elektroporasyon tarafından tanıtıldı. 72 saat sonra hücreleri FACS kullanarak ve ( şekil 3′ te deneysel işlem resimli) 96-şey tabak içine tek tek sıralanmış analiz edildi. Yeşil Floresans görüntüleme hücreleri 96-şey plaka klonal genişleme için bireysel kuyu içine Akış Sitometresi tarafından sıralanmış. Önemlisi, hücreleri eGFP ifade eksik da izole ve genişleme aynı koşullar altında için benzer bir şekilde sıralanır. Büyüme 14 gün sonra çoğu bireysel klonların DNA izolasyon etkinleştirmek için yeteri kadar genişletti. Bu nedenle, eGFP pozitif örnekleri 16 klonları seçildi ve hedef site çevreleyen genetik bütünlük DNA sıralama tarafından analiz edildi. Nüfus içinde gen DNA dizisi çevreleyen bilgiler sıralama, wildtype gen (şekil 4A) sırasını karşılaştırmak için sıra görselleştirme yazılımları kullanarak monte Sanger kullanılarak oluşturuldu. RNP kompleks Kesme Makinası (2 C crRNA) bar yeşil üzerinde bulunan siyah bir ok ile gösterilir. De gösterildiği gibi şekil 4A, hedef site tahmin edilen nükleotit borsada tüm 16 eGFP pozitif hücreler içerir. Dönüştürülen C kalıntı kırmızıyla vurgulanır ve kesin bu değişikliği yansıtan en yüksek profil altında eGFP pozitif sıra sağlanır. Benzer bir şekilde, 15 sigara-yeşil klonal izole, yeterince DNA ekstraksiyon etkinleştirmek için genişletilmiş ve sıralama, heterojenlik, hedef site için analiz edildi. Tahmin edilebileceği gibi yaklaşık yarım örneklerinde, DNA Bankası takas gözlendi. Bu hedef site de G kalıntı bakım şekil 4B’ gösterildiği gibi yansıyor. Bu deneyler incelendiğinde klonal Açılımları geri kalanı silme mutasyonlar, bu nedenle yeşil Floresans olmaması için muhasebe türdeş olmayan bir nüfusa görüntülenir. Silme boyutu bir baz 19 üsleri arasında değişiyordu. Biz sadece eGFP pozitif hücre 15 örnekleri inceledik ve bu tür genetik lezyonlar CRISPR/Cas9 faaliyete göre geride bir oldukça temsilcisidir inanıyorum iken, bir olasılık olduğunu bu diğer türleri veya indels türlü unutmamak gerekir Hedef nüfus mevcut olabilir. Birlikte ele alındığında, şekil 4 ‘ te gösterilen sonuçlarını sistemi hedefleme eGFP fenotipik okuma onaylayın. C nükleotid G dönüşüm sağlayan yeşil Floresans düzeltilmiş HCT116 hücrelerdeki ortaya çıkması. Hedef site çevresindeki hiçbir temel ikame bu deneme için izole klonlar veya önceki deneyler27,28gözlenmiştir. Verileri da hücrelerin gen noktası-mutasyon onarım düzenleme geçmesi başarısız ama Düzeltilmemiş, genetik heterojenite hedef site çevreleyen bir dizi ile değiştirilmemiş değil bazı durumlarda kalır göstermektedir. Şekil 1. (A) gen mutant eGFP gen düzenleme için modeli sistemi. Wildtype ve mutasyona uğramış eGFP gen sırası, merkezinde yer hedefli kodonu ile uygun parçalarını yeşil ve kırmızı, sırasıyla görüntülenir. Karşılığında hedef nükleotit kalın ve altı çizili. Vurgulanan mavi temsil 2 C CRISPR protospacer sıra üsleri ve turuncu üsleri PAM sitesini vurgulayın. Bu deneylerde kullanılan Oligonükleotid uzunluğu, modifiye phosphorothioate bağlantıları üç terminal üsleri yatak 72 üsleri olduğunu; 72-mer sigara transkripsiyonu (NT) strand (72NT) hedefler. (B) CRISPR/Cas9Ribonükleoprotein derleme tepki. crRNA tracrRNA (yeşil) ile 2 C protospacer sıra ile etkileşim etki alanı (mavi) için karşılık gelen hedef özgüllük (20 üsleri, kırmızı bölüm) sağlar. crRNA ve tracrRNA ekimolar konsantrasyonlarda komplementer. Cas9 protein (gri) RNP derleme tamamlamak için eklenir. Hangi sonra hedef DNA ayırmak Kılavuzu RNA’ların (gRNAs) doğrudan ve Cas9 endonükleaz etkinleştirin. Şekil alt bölümünde 2 C tohum sırası ve tracrRNA sıra gösterilir. Bu rakam Rivera-Torres, N. ve ark. güncellenmiştir (2017). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2. Düzenleme Gene doz bağımlı ne zaman yönettiği RNP ve ssODN. Senkronize ve HCT 116-19 hücreleri electroporated CRISPR/Cas9 RNP 24-120 pmol ve 0,6-3.0 ile serbest bırakıldı µM, 72mer. 72-h kurtarma döneminden sonra bir Akış Sitometresi kullanarak gen düzenleme etkinliği ölçülmüştür. Gen düzenleme hücrelerin nüfus toplam sayısı bölü eGFP pozitif hücrelerin sayısına göre belirlenen düzeltme verimlilik (%) olarak görüntülenir. Hata çubukları üç standart hata temel hesaplamaları kullanarak üç ayrı deneyleri üzerinde oluşturulan veri noktaları kümesi üzerinden üretilmektedir. İç metin: tek ajan gen düzenleme. Gen düzenleme etkinliği aynı koşullar altında karmaşık RNP yokluğunda tek iplikçikli Oligonükleotid (72NT) Yönetmen konsantrasyonu artan bir fonksiyonu sunulur. Bu rakam Rivera-Torres, N. ve ark. güncellenmiştir (2017). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3. Tek hücre klonlar yalıtım için deneysel stratejisi. EGFP ifade sergileyen hücreleri olarak pozitif ve sıralanmış bir Akış Sitometresi tek hücreler olarak bireysel kuyu klonal gelişmemiz kullanarak skorlanmıştır. EGFP ifadesi eksik hücreleri izole ve benzer şekilde sıralanmış ve aynı koşullar altında genişletilmiş. O zaman DNA’sı izole ve eGFP gen güçlendirilmiş ve Sanger için tabi hedef site çevreleyen gen düzenleme etkinliğini çözümlemeye sıralama. Bu rakam Rivera-Torres, N. ve ark. güncellenmiştir (2017). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4. (A) allelic analiz eGFP pozitif hücrelerinin genişletilmiş klonal bir popülasyon olarak. Clonally izole ve genişletilmiş eGFP pozitif örnekler (on altı klonları) hedeflenen Bankası ve DNA her birinden çevreleyen sitesinde analiz, hasat, saf, güçlendirilmiş ve sıralı. Allelic analiz sıralama sırası görselleştirme yazılımları kullanarak monte ve rakam üst kısmında resimli wildtype Gen dizisi göre Sanger kullanılarak gerçekleştirilmiştir. RNP kompleks kesme makinası küçük siyah bir ok yeşil bar (2 C crRNA) yer alan olarak belirtilir. (B) EGFP negatif hücre allelic analiz genişletilmiş klonal bir popülasyon olarak. On beş bireysel örnekleri, Düzeltilmemiş nüfus kaynaklanan klonlar üzerinden genişletilmiş rastgele seçilen ve hedef nükleotit çevreleyen sitesinde Indel oluşumu için analiz. Olarak yukarıda, allelic analiz sıralama ve bir sıra görselleştirme yazılım kullanarak monte Sanger kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bir kez daha, RNP kesme makinası ile birlikte şekil üstündeki wildtype gen dizisini sunulmaktadır. Bu rakam Rivera-Torres, N. ve ark. güncellenmiştir (2017). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Düzenleme Gene bir ana akım bilimsel disiplin öncelikle CRISPR/Cas9 sistem çıkması nedeniyle ortaya çıkmıştır. Bakteri hücreleri içinde evlat edinen dokunulmazlık kolaylaştırır, bu olağanüstü yolu insan kromozomlarının genomik değişiklik etkinleştirmek için moleküler bir araç olarak repurposed. CRISPR/Cas9 doğal viral DNA çift iplikçikli DNA sonları parçalanma30,31olarak lider getirerek devre dışı bırakmak için fonksiyonudur. Bu etkinlik eksojen DNA işgalci imha neden olur ve sonraki enfeksiyon tarafından aynı viral parçacık bastırır prokaryotik dokunulmazlık yol açar. Şaşırtıcı, önceki enfeksiyon olaylar tarafından oluşturulan özel CRISPR gRNA yeniden etkinleştirebilirsiniz, bu sistem öğretilenbir davranışı sergiler.

Verimlilik ve CRISPR/Cas9 tarafından katalize gene bozulma doğruluğunu kullanılan çok sayıda ökaryotik genetik sistemlerinde amaç işleyen bir gen32,33devre dışı bırakmak için neredeydi. Ne zaman onun Bazal seviyeye indirimli, işlemi iki temel adımlardan oluşur. İlk çift iplikçikli mola ise ikinci doğal homolog olmayan son nakavt tamamlamak için (NHEJ) katılmadan üzerinde dayanır. Çoğu durumda, çift iplikçikli sonu sonuçları künt uçlu oluşturulmasında serbest kromozom parçaları ve enzim NHEJ içinde yer alan kromozom kırmak için tepki ve kırık uçları bağlamak için hareket. Bu işlem bazen kesik sitesinde bireysel nükleotit kaybı içerebilir. Hatta bir kaç üsleri kaybı bir frameshift neden olabilir ve fonksiyonel ifade erer. NHEJ doğal süreci meşgul olarak genetik nakavt oluşturmak için CRISPR/Cas9 kullanımı ökaryotik genetik devrim vardır; hedef site DNA tahmin edilebilir ve beklenen kayıptır.

Gen nakavt aksine, araştırmacılar bir dizi yeniden yönlendirmek ve CRISPR/Cas9 aktivite homoloji yönetmen onarım süreci doğru repurpose çalışırken meşgul edilmiş. Çalışmalar gen düzeltme amaçtır. Bu strateji, CRISPR/Cas9 doğuştan bir hata onarım veya mutasyonlar sağlıklı genleri eklemek için genetik bilgi sağlar bir donör DNA şablonu ile birleştirilmiştir. İlk raporlar CRISPR/Cas9 olağanüstü kapasitesi homoloji yönetmen onarım katalizler vurgulama (doğrudan veya dolaylı olarak) süreci içinde son derece hassas moda24,34oluştuğunu belirtti. Bizim laboratuvar onarım homoloji yönetmen ya da gen düzeltme mekanizması ve düzenleyici devre15,17,18 çevreleyen tanımlamak için bir girişim tek iplikçikli oligonucleotides kullanarak eğitim ,23. Öncelikle birçok kalıtsal bozukluklar için sorumlu olduğu bilinen en temel genetik mutasyon bu yana tek nokta mutasyonlar, düzenleme gen üzerinde odaklanmıştır. Gen düzenleme bizim temel bilgi CRISPR/Cas9 aktivite bu reaksiyonlarda duyarlığını gen nakavt sonuçları indels oluşumunda CRISPR/Cas9 işlevinde beri soru için bize yol. Biz iyi tanımlanmış modeli sistemi yerine bir sigara tarafından seçilebilen henüz klinik gen kesinlikle indirgemeci moda yerinde mutagenesis çalışırdım. Hangi gen düzeltme her iki genotypic ve fenotipik düzeylerinde, ölçülebilir bir basit hedef gen kullanarak hedef sitede meydana gelen heterojenite güvenilir ve sağlam bir şekilde tespit edilmesi gerekçeli.

Bizim veri sistem düzenleme köklü gen bir mutant eGFP oluşan HCT116 hücre entegre gen sağlayabilir ki genetik lezyonlar ve yerinde mutagenesis sürecinin üretimi ile ilgili temel bilgileri onaylayın. Tandem çalışmak CRISPR/Cas9 ve tek iplikçikli Oligonükleotid donör DNA molekülün nokta mutasyon eGFP gen hassas tamiri yol açabilir. Biz nokta mutasyonlar, hangi donör DNA onarım mutant tabanının, tam30olarak adlandırdığı bir işlem için bir çoğaltma şablon görevi görür bir moleküler yol tamiri için yeni bir model öneriyoruz. Düzeltilmiş fenotip sergileyen değil hedeflenen nüfus içeren türdeş olmayan ve yaygın olarak hedef site çevreleyen DNA indels arasında değişen hücreleri çeşitli görüntüler. Düzeltilmemiş nüfus izole yaklaşık yarım klonlar, silme mutagenesis hedef sitede gözlendi. Bu yana önceki rapor tek iplikçikli oligonucleotides, tek-ajan gen düzenleme araçları indels hedef alanında teşvik edebilirsiniz olarak hareket biz CRISPR/Cas9 aktivite bu mutasyonlar için sorumlu olduğu sonucuna belirtti.

Bu el yazması biz ayrıntılı bir metodoloji sağlamak, böylece genetik heterojenite hedef sitesinde güvenilir ve sağlam bir şekilde ölçülebilir. Süre dikkat çok büyük miktarda analiz için ödenen ve off-site mutagenesis eşleme, türdeş olmayan bir mutasyon hedef sitede oluşturulan başarılı veya başarısız klinik arenada düzenleme gen üzerinde büyük etkisi vardır. Ek teknolojiler veya değiştirilmiş Cas9 proteinler memeli hücreleri35doğuştan hataları homoloji yönetmen tamir duyarlığını geliştirmek için gerekli olabilir. Bazı bu teknolojilerin kromozom uçları bir arada tutan ve NHEJ yıkıcı eylem kaçınarak bir köprü hareket etmek yardımcı oligonucleotides kullanımını içerir. Heterojenite gen düzenleme etkinliği sonucunda hedef sitede derecesini tanımlama, terapötik müdahale için tasarlanmış herhangi bir protokol önemli bir parçası olmalıdır.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar hiçbir ilgili kaynaklar var.

Materials

McCoy’s 5A Modified medium ATCC 30-2007
Fetal Bovine Serum (FBS) ATCC 30-2020
L-glutamine ATCC 30-2214
Penicillin-Streptomycin Solution ATCC 30-2300
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ATCC 30-2200 No Calcium or magnesium
Trypsin EDTA Solution ATCC 30-2101
Aphidicolin 1mg Thermo Fisher AC611970010
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol IDT No catalog number since its made to your specific gene target.
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol IDT 1072533
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg IDT 1074182
IDTE Buffer IDT 11-01-03-01
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm VWR 10497-474
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems BioRad 1652660
Bovine serum albumin
lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE)		 Sigma 05470-1G
EDTA (0.5 M), pH 8.0 ThermoFisher Scientific AM9260G
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water ThermoFisher Scientific P3566
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69581
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates VWR 10062-892
Petri Dishes Fisher 12-565-90
Conical Tubes (15 mL) (racked) Thermo Fisher AM12500
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Reduced Serum Medium Thermo Fisher 31985062
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  2. Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
  3. Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
  4. Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Génétique. 93, 2071-2076 (1996).
  5. Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
  6. Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
  7. Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
  8. Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
  9. Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
  10. Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
  11. Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
  12. Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
  13. Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
  14. Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
  15. Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
  16. Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
  17. Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
  18. Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
  19. Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
  20. Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
  21. Wang, Z., Zhou, Z. -. J., Liu, D. -. P., Huang, J. -. D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
  22. Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
  23. Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
  24. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  25. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  26. Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a., Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791 (2014).
  28. Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308 (2015).
  29. Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
  30. Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350 (2017).
  31. Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
  32. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  33. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  34. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
  35. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).

Tags

CRISPR/Cas9SsODNOn-site MutagenesisHomology Directed RepairGene CorrectionHTT116 CellsTrypan BlueHemocytometerAphidicolinEGFP GeneGuide SequencesCrRNATracrRNA

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells. J. Vis. Exp. (126), e56195, doi:10.3791/56195 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image