JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Génétique

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/56195
,
1Gene Editing Institute, Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute,Christiana Care Health Services, 2Department of Medical Sciences,University of Delaware

Summary

Этот протокол определяет рабочий процесс на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования системы для ремонта точечные мутации в mammalian клетках. Здесь, мы используем комбинаторный подход к Джин редактирования с подробной последующей экспериментальной стратегии для измерения indel формирования на целевом сайте — по сути, анализ на месте мутагенеза.

Abstract

Комбинаторные гена редактирования с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и одноцепочечной олигонуклеотидов является эффективной стратегией для коррекции сингл база точечные мутации, которые часто несут ответственность за целый ряд наследственных заболеваний человека. С помощью системы устоявшихся моделей на основе клеток, Точечная мутация гена одной копии мутант eGFP, интегрированы в HCT116 клетки был восстановлен с использованием этой комбинаторный подход. Анализ исправлениями и неисправленных клетки показывает точность редактирования гена и развития генетических повреждений, когда indels создаются в неисправленный клеток в последовательности ДНК, окружающих на целевом сайте. Здесь изложены конкретные методологии, используемой для анализа этой комбинаторный подход к редактированию гена точки мутации, в сочетании с подробные экспериментальные стратегии измерения indel формирования на целевой сайт. Этот протокол определяет основополагающий подход и рабочий процесс для расследований, направленных на развитие на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена, редактирования для человека терапии. В завершение этой работы является что занятия мутагенеза происходит в результате ТРИФОСФАТЫ/Cas9 активность в процессе ремонта Точечная мутация. Эта работа ставит на место стандартной методологии для определения степени мутагенеза, которая должна быть важным и критическим аспектом любого подхода, предназначенного для клинических осуществления.

Introduction

Пионерские исследования Mandecki (1986) продемонстрировал постоянные изменения в ДНК плазмиды, используя олигонуклеотиды, превращается в бактерии1, тогда как Уолдер и Уолдер (1986) провел аналогичные исследования в дрожжи2. Вскоре после этого Шерман и коллеги опубликовали ряд документов, в которых одноцепочечной олигонуклеотиды были введены в клетки дрожжей сделать наследственные изменения в генах3. Опираясь на плодотворную работу в микробной клетки, Kmiec и его коллеги начали разрабатывать уникальные олигонуклеотиды одного агента, которые направлены единого базового ремонта в mammalian клетках4. Эта концепция была основана на биохимические данные показали, что молекулы, подшипник RNA связывают более плотно на целевой сайт, чем те, которые полностью состоят из оснований ДНК. Хотя поступали многочисленные сообщения о Джин редактирования успеха, используя химерных олигонуклеотиды5,6,7, редактирования уровней по-прежнему сильно варьирует между эксперименты и различных целевых/ячейки комбинации.

Доноров одноцепочечной ДНК является предпочтительным для доноров двуцепочечной ДНК, потому что это менее вероятно, интегрировать наугад сайтов в геном8. Однако экзогенно представлен одноцепочечной олигонуклеотиды, склонны к быстрой деградации, сотовый nucleases. Были использованы несколько стратегий для защиты Термини олигонуклеотиды от деградации. При exonuclease защищенный, одноцепочечной ДНК, содержащие нужную последовательность было достаточно, чтобы получить редактирования эффективность в 0,1-1% диапазона6. Улучшена и более последовательной методов трансфекции, в сочетании с фенотипическими отсчетов, позволило для более последовательного редактирования несколько исследовательских групп8,9,10,11, 12,13.

За последние 10 лет был значительные усилия, чтобы сделать более пригодным для редактирования гена клеток-мишеней. Одна из стратегий использует модуляции клеточного цикла14,,1516. Во время редактирования частоты в условиях нормальной реакции с одноцепочечной олигонуклеотиды (ssODNs) введена в культивируемых клеток млекопитающих завис между 0,1% и 1%, частоты генов, редактирование более 3 – 5 раз когда олигонуклеотиды были введены в клетки во время перехода через S-фазе. В отдельной серии экспериментов Бракман и Kmiec (2005) продемонстрировали, что относительно высокий уровень гена точного редактирования (3-5%) были получены при 2’3 ‘ dideoxycytosine (ddC) был инкубировали в клетках за 24 ч до введения олигонуклеотида17 . ddC уменьшает скорость движения вилка репликации ДНК, предполагая, что ген редактирования, ssODNs в репликации клетки вероятно предполагает включение ODNs в районах активной репликации11,18. Взятые вместе, эти исследования привели к концепции, что доноров ДНК становится частью вилкой растущего репликации истинной механизма действия гена редактирования, независимо от того, присутствует ли перерыв двуцепочечной или не19. Таким образом коррекция Точечная мутация или замена сегмент ДНК в пределах хромосомы происходит через ДНК сопряжения и путь один стренги ассимиляции.

Вызывая случайных двуцепочечные разрывы ДНК в клетки с агентами мелкомолекулярных создает обстановку, в которой события репликации ДНК зашли в тупик как клетка пытается восстановить повреждения20,21. Это временное замедление в Форкс репликации позволяет более эффективного проникновения структуре хроматина, одноцепочечной редактирования олигонуклеотиды, повышение доступности целевой15. Создание double-stranded дна ломает, наркотики, такие как VP16, блеомицин, или камптотецина22,23, было показано, чтобы стимулировать ген редактирования уровней, почти в 10 раз, до 6-8%. Тем не менее случайные разрывы двуцепочечной ДНК являются нежелательными в терапевтических обстановке.

Редактирование с помощью программируемых nucleases и олигонуклеотиды гена стимулируется также во время разделения клетки24,25. Когда осуществлять ориентированные на гомологии ремонт в синхронизированном HCT 116 клеток был использован доставки на основе нуклеиновых кислот, Торрес Ривера и его коллеги продемонстрировали же увеличение ориентации деятельности когда транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) работали с одноцепочечной олигонуклеотиды, оба в репликации клеток населения26,27 . Совсем недавно, Bialk и его коллеги показали, что ремонт одного базового мутации с одноцепочечной олигонуклеотиды и массив кластерного регулярно interspaced короткие палиндром повторяет Cas9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) молекул происходит с более высокой эффективности когда популяции клеток обход S фазу28. ТРИФОСФАТЫ молекула состоит из РНК и функций для определения региона в рамках целевой последовательности ДНК, предназначенный для расщепления. Cas9 является бактериальный фермент, функция которого заключается в том, чтобы расщеплять двуцепочечной ДНК в nucleolytic реакции обмена. Таким образом ТРИФОСФАТЫ позиций комплекс на genomic цели, и Cas9 Нуклеаза выполняет двунитевая перерыв. Линь и др. (2014) также продемонстрировали важность клеточного цикла для достижения высоких частот гена редактирования, с помощью модифицированных ТРИФОСФАТЫ/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) комплекс опосредованной системы доставки в первичной неонатальной фибробластов, человеческих эмбриональных стволовых клеток, и другие клетки линии24. Таким образом отношения, установившиеся между гена редактирования и клеточного цикла прогрессии для одного агента гена редактирования применима к комбинаторной гена редактирования с использованием программируемых nucleases и доноров ДНК шаблоны. Хотя комбинаторный подход к редактированию гена приняли участие целого ряда партнеров с шаблоном ДНК доноров, большинство работников в поле использовать ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для обеспечения функции двунитевая перерыв. Этот выбор основывается на удобство использования этого конкретного генетического инструмента и гибкость, с которой он может быть использован для отключения функции гена или ввести иностранных кусок ДНК в определенном сайте. Поколение нокаут технически проще по сравнению с Джин замена, где включение «правильной» или нормальной копий гена в сайт болезнь должна осуществляться с точностью. Ряд исследователей выявление и изучение использования конкретных наркотиков и реагенты, позволяющие коррекции мутант базы и вставки нормальной генетических последовательностей в правильном положении на повышенные частоты29.

Недавно, Ривера Торрес и др. 30 используется комбинаторной гена редактирования, воспользовавшись двунитевая перерыв деятельности специально ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы и генетической информации, представленной шаблон ДНК одноцепочечной олигонуклеотида доноров, для ремонта Точечная мутация водна копия гена расширенной зеленого флуоресцентных белков (eGFP) интегрированы в HCT116 клетки. Авторы воспользовались этой линии клеток хорошо изученных моделей для оценки специфика декольте вокруг целевого сайта. Данные показывают, неоднородности в целевой сайт существует, особенно в клетках, которые не содержат исправленные Точечная мутация. В этой рукописи, мы подробно и сосредоточиться на методологию, используемую этими работниками для изучения на месте мутационного неоднородность, созданный ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования.

Protocol

следующий протокол включает работу с mammalian клеток; предполагается знакомство с стерильных техника/клеточная культура. 1. клеточная линия и культуры условия сделать 500 мл среды для культуры клеток HCT 116: Маккой ' s 5А изменение средних с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамина и пенициллина 1% (это полный Средний). Примечание: Растут HCT 116-19 клетки в T-75 или T-175 колбу до покрытия. Когда 90% притока, каждый T-75 колбу даст 8.4 x 10 6 клеток, примерно пять 10-см пластины, и каждый T-175 даст 18,4 х 10 6 клеток, примерно пятнадцать плиты 10-см. 2. Уборка клетки из колбы аспирационная от среднего, мыть с Дульбекко ' s Phosphate-Buffered солевой без кальция и magniesium (PBS) (10 мл для T-75 или 25 мл для T-175) и аспирата. Добавить трипсина прикапывают в колбу с помощью пипетки 2 мл (2 мл для T-175 или 1 мл раствора для T-75). Место колбу в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 на 5 минут, чтобы позволяют клеткам отсоединить. Кран колбу, чтобы убедиться, что все клетки выбили и затем утолить с полного среднего, разогнать его по всей поверхности колбы (8 мл для T-175 или 4 мл T-75). Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы разбить ячейку сгустки и передачи клетки 15 мл Конические трубки Перед спиннинг клетки вниз, принять 10 мкл от 15 мл конические и объединить его с 10 мкл Трипановый синий подсчитать количество ячеек. Пелле клетки, спиннинг для 5 мин при 125 x g и 16 ° C. 3. Подсчет клеток передачи 10 мкл клетки смешивают с Трипановый синий Горяева. Всего 4 сетки вокруг внешней (каждая клетка содержит 16 квадратов). Взять средний мобильный граф из каждого набора из шестнадцати углу квадратов. Умножить на 10 000 (10 4). Умножить на общий объем средство, используемое для сбора клеток исправить для разбавления Трипановый синий сложения. Примечание: Формат уравнения для вычисления объема для Ресуспензируйте клетки следующим образом: 4. Покрытие клетки для каждого 10-см пластины клеток для синхронизации, добавить 5 мл полного среднего и 6 мкм aphidicholin (12 мкл 2,5 мм запаса в 200-доказательство этанола). Передачи 100 мкл вновь приостановлено ячейки Пелле, 2,5 х 10 6 клеток, каждый 10-см пластины и вихрем осторожно, чтобы смешать. Инкубировать пластин при 37 ° C и 5% CO 2 для 16-24 ч для синхронизации клетки на границе G1/S. 5. Выпуская клетки от синхронизации Aphidicolin 4 h до ориентации, аспирационная среды, мыть с PBS, аспирационная PBS и добавить 5 мл полной среды поместить его обратно в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 для 4 h 6. РНК комплексообразующие Ввод последовательности гена мутант eGFP в лабораторию Чжан ' s онлайн генератор 25 (http:// crispr.mit.edu/) и выбрать руководство ТРИФОСФАТЫ последовательностей, которые связывают с непосредственной близости на целевой сайт. Получить руководство ТРИФОСФАТЫ последовательности от коммерческого источника. Хранить ТРИФОСФАТЫ РНК (crRNA), транс активация crRNA (tracrRNA) и Cas9 белков при 20 ° C и использовать согласно производитель предложения. Смесь РНК в эквимолярных концентрации до 45 мкм. добавить 6,75 мкл 200 мкм запас crRNA и 6,75 мкл 200 мкм запасов tracrRNA в центрифугу 1,5 мл трубки. 16.50 мкл TE буфер, чтобы сделать окончательный объем 30 мкл. Тепла при 95 ° C за 5 мин в блоке тепла или ПЦР машины. Внимание: Горячий! Дайте остыть до комнатной температуры. Примечание: Если с помощью ПЦР машины, установки охлаждения до 0,2 ° C/s. Выполните следующие действия для каждого образца. Развести 2.22 мкл crRNA:tracrRNA комплекс в 2.78 мкл буфера TE (10 мм трис, pH 8.0 и 0,1 мм ЭДТА; рН 8.0) в окончательный объем 5 мкл. Развести 1,67 мкл Cas9 белка от 60 мкм складе 3,33 мкл среднего низкий сыворотка окончательный объем 5 мкл. Смесь 5 мкл Cas9 белка с 5 мкл complexed РНК 7. Уборка клетки для нападения аспирата средний, мыть с 5 мл PBS, аспирационная PBS и добавьте 1 mL подогретым трипсина на каждой пластине 10-см. Поместите пластины в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 на 5 мин Нажмите на пластину 10-см, чтобы убедиться, все клетки выбили и затем утолить с 4 мл полного среднего, разогнать его по всей поверхности пластины. Пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы разбить ячейку сгустки и передать 15 мл Конические трубки клетки. Перед спиннинг клетки вниз, принять 10 мкл от 15 мл Конические трубки и объединить его с 10 мкл Трипановый синий подсчитать количество ячеек. Пелле клетки, спиннинг для 5 мин при 125 x g и комнатной температуре. Аспирационная среднего и мыть с 5 мл ФСБ. Пелле клетки, спиннинг на 125 g x 5 мин при комнатной температуре. 8. Подсчет клеток передачи 10 мкл клетки смешивают с Трипановый синий Горяева. Всего 4 сетки вокруг внешней (каждая клетка содержит шестнадцать квадраты). Взять средний мобильный граф из каждого набора из шестнадцати углу квадратов. Умножить на 10 000 (10 4). Умножить на общий объем средство, используемое для сбора клеток исправить для разбавления Трипановый синий сложения. Примечание: Ниже приводится формат уравнения для вычисления объема для Ресуспензируйте клетки. Вновь приостановить необходимое количество клеток в сыворотке бесплатно Маккой ' s 5А изменение среднего. 9. Ориентация образцов передачи 100 Мкл суспензии клеток (5 x 10 5 клетки) из шага 8.1 для каждого 4-мм зазор кювет электропорации. 10 мкл RNP комплекса, от шаг 6,7 до 100 мкл клеток на плотности тарелок 5 x 10 5 клеток. Добавить ODN (2 мкм) для каждой выборки. Примечание: Для позитивного элемента управления, добавить 1 мкл eGFP на 1 мкг/мкл, выражая плазмида взять стойки к машине, электропорация, слегка Флик каждый образец и поместите их в камере. Electroporate на 250 V, LV; 2 импульсы, 1 s; 13 мс; Униполярный пульс. Передачи стойки капота. Передать каждый образец хорошо содержащие 2 мл полной среды яn 6-ну пластины. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO 2 за 72 часа перед проверкой для коррекции уровня. 10. Анализ гена редактировать клетки и эффективности Transfection аспирационная среднего и вымыть клетки с 2 мл ФСБ. Аспирационная PBS и 500 мкл подогретым трипсина в каждой скважине пластину 6-хорошо. Поместите пластины в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 на 5 мин Кран пластину, чтобы убедиться, все клетки выбили и затем утолить с 1 мл раствора полного среднего, разогнать его по всей поверхности колодца. Пройти клетки в 1,5 мл пластиковых пробирок и Пелле на 5000 g x 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная среды. Вновь приостановить Пелле клеток в 500 мкл буфера СУИМ (0,5% BSA, ЭДТА 2 мм и 2 мкг/мл пропидий йодидом в PBS). Измерения флуоресценции клеток (eGFP +) подачей cytometry. Расчета эффективности коррекции как процент всего живой eGFP положительных клеток над общее количество живых клеток в каждой пробе, как описано в Торрес Ривера и др 30. 11. Анализ последовательности ДНК Electroporate синхронизированы и выпустила HCT 116-19 клетки в концентрации 5 x 10 5   клеток/100   мкл, с RNP комплекс на 100 pmols и 72NT ODN на 2,0 мкм. Передача клетки 6-ну пластины и дать им возможность восстановить за 72 ч. Сортировать клетки индивидуально в 96-луночных пластины с помощью СУИМ сортировщик с лазером (100 МВт) 488-нм для eGFP + /-, как описано в Ривера-Торрес и др 30. Примечание: Не все скважины будет успешно расти. Расширения клетки более 6 недель и урожай, как описано в шаге 7. Из скважин, которые имеют рост, изолировать сотовой геномная ДНК, использование коммерчески доступных изоляции ДНК комплекта (см. Таблицу материалы) и усилить региона вокруг целевой базы через PCR (718 bp; вперед грунтовка 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' и обратить вспять грунтовка 5 ' – ACTTGTACAGCTCGTCCATGC – 3 '). Анализ последовательности ДНК, выполняют на образцах.

Representative Results

Мы использовали систему модель для изучения гена редактирования в mammalian клетках, который опирается на коррекции Точечная мутация, внедренные в гене eGFP, интегрированных качестве одной копии в HCT116 клетках. Важно отметить, что это одной копии гена; Таким образом могут быть сделаны менее сложный вид изменения ДНК или мутагенез. Рисунок 1A отображает последовательности ген мутанта eGFP с целевой базой, третья база стоп кодон тег, выделены красным цветом. Олигонуклеотида 72-база, которая частично дополняет стренги транскрипции гена eGFP (72NT) и призвана побудить базы exchange от G до C, также Иллюстрированный. Кроме того ТРИФОСФАТЫ, назначил 2C, с последовательностью указанный protospacer в 5′ к 3′ ориентации, также изображен на рисунке 1A. Для выполнения этой реакции, ген редактирования, мы использовали рибонуклеопротеида (RNP), состоящий из ТРИФОСФАТЫ (cr) РНК, РНК tracr (tr), в сочетании с очищенный протеин Cas9 (рис. 1B), вместо млекопитающих выражение вектор, состоящий из Cas9 гена и соответствующие конкретные руководство РНК последовательности. Когда специально частиц RNP поставляется с одноцепочечной олигонуклеотида в HCT116 клетки, электропорация, Джин редактирования, подтверждается ремонт единый базовый мутации в eGFP, наблюдается после 72 ч инкубации с помощью потока цитометр. Функциональный ремонт наблюдается появление зеленого флуоресценции в целевые клетки, клетки, которые также могут быть отделены от всего населения путем сортировки из-за этого флуоресценции. Как показано на рисунке 2, ответ постепенно дозу можно рассматривать как скоординированных уровни RNP и 72NT увеличения. Молекулярном соотношении, пикомоль RNP и обработку концентрации 72NT, как показано на рисунке, основаны на оптимальные дозы, используемые в Джин редактирования реакциях, которые зависят от внедрения Cas9 и конкретных руководство РНК из transfected выражения векторы. Врезные в рисунке 2 показывает ген редактирования реакция осуществляется в отсутствие RNP частицы. Здесь около 1% целевых клеток исправлены когда десятикратного высокую концентрацию олигонуклеотида 72NT используется в Джин редактирования реакции одного агента. Для того, чтобы определить, существует ли генетической гетерогенностью на целевой сайт так называемой территории мутагенеза эффект-мы решили изучить итоги гена редактирования деятельности в отдельных клетках. В то время как гораздо более трудоемкий, чем изучение общей численности населения, истинная мера генетических следов или поражения может быть установлено, когда рассматривается геном клонально расширенной клеток. Мы повторили эксперимент, описанные в Рисунок 2, на этот раз, используя только 100 пмоль RNP комплекс и 2.0 мкмоль олигонуклеотида 72NT. Как выше, HCT 116 клетки были синхронизированы для 24 ч с aphidicholine и арестован на границе G1/S. После 4 ч, клетки были освобождены и инструменты редактирования гена были введены электропорации. 72 h позже, клетки были проанализированы с помощью СУИМ и отсортированный индивидуально в 96-луночных пластины (экспериментальный процесс проиллюстрирован на рис. 3). Отображение зеленый флуоресценции клеток были отсортированы по проточной цитометрии в индивидуальные добра 96-луночных плиты клоновых расширения. Важно отметить, что клетки, отсутствует выражение eGFP были также изолированные и сортируются в Аналогичным образом для расширения на тех же условиях. После 14 дней роста большинство отдельных клонов расширились достаточно для включения изоляции ДНК. Таким образом были отобраны 16 клоны eGFP положительных образцов, и генетические целостности, окружающих целевой сайт был проанализирован секвенирования ДНК. Информации вокруг последовательности ДНК аллелей в рамках населения был создан с помощью Сэнгер виртуализации, собранные с помощью программного обеспечения для визуализации последовательности для сравнения последовательности аллеля wildtype (рис. 4A). Вырезать сайт комплекса RNP обозначается черной стрелкой, расположенный на зеленый бар (2C crRNA). Как также показано на рисунке 4Aвсе 16 eGFP положительных клеток содержат предсказал нуклеотидов обмен на целевом сайте. Преобразованные C остатков будет выделена красным цветом, и пик профиль, отражающие что точные изменения предоставляется под eGFP положительных последовательности. Аналогичным образом 15 не зеленый клоновых изолятов, достаточно расширены для включения экстракции ДНК и виртуализации, были проанализированы на неоднородность на целевом сайте. Как предсказано, примерно половина на образцах было отмечено отсутствие обмена базы ДНК. Это отражено в поддержании G остатков на целевой сайт, как показано на рисунке 4В. Остальная часть клоновых расширения, рассмотрены в этих экспериментах отображается гетерогенных населения удаления мутаций, поэтому приходится отсутствие зеленой флуоресценцией. Удаление размер варьировались от одной базы до 19 баз. Важно отметить, что мы рассмотрели только 15 образцов eGFP положительных клеток, и хотя мы считаем, что это довольно представитель типа генетических повреждений оставленные ТРИФОСФАТЫ/Cas9 деятельности, существует возможность, что других видов или форм indels может присутствовать в целевой популяции. Взятые вместе, результаты, отображаемые на рисунке 4 подтверждают фенотипические индикация в eGFP, ориентация системы. Преобразование G C нуклеотидов позволяет появление зеленого флуоресценции в исправленный HCT116 клеток. Подстановка базы, вокруг целевого сайта было отмечено в клонов, изолированные для этого эксперимента или в предыдущих экспериментов27,28. Данные также показывают, что клетки, неспособность пройти редактирования через ремонт Точечная мутация гена остаются некомпенсированная, но в некоторых случаях, не в неизмененном виде, с широкий спектр генетической гетерогенностью окружающих на целевом сайте. Рисунок 1. (A) модель системы для редактирования ген мутанта eGFP гена. Соответствующие сегменты wildtype и ген мутировал eGFP с целевой кодон, расположен в самом центре последовательности, отображаются в зеленый и красный, соответственно. Нуклеотид, предназначенных для обмена является полужирным и подчеркнул. Пометки баз в голубой представляют последовательность protospacer 2C ТРИФОСФАТЫ, и оранжевый основания выделить на сайте PAM. Олигонуклеотида используемых в этих экспериментах — 72 баз в длину, принимая фосфоротиоат изменение связей на три терминала базы; 72-mer цели стренги (NT)-транскрипции (72NT). (B) ТРИФОСФАТЫ/Cas9рибонуклеопротеида Ассамблеи реакции. crRNA предоставляет целевой специфичность (раздел 20 баз, красный) соответствует последовательности protospacer 2C и взаимодействия домена (синий) с tracrRNA (зеленый). crRNA и tracrRNA отжигу в эквимолярных концентрации. Cas9 белка (серый) добавляется для завершения Ассамблеи RNP. Руководство РНК (оформления) прямые и активировать Cas9 эндонуклеазы, который затем прилепится ДНАО цели. В нижней части цифра показывает последовательность семян 2C и tracrRNA последовательность. Эта цифра была изменена с Ривера-Торрес, н. и др. (2017). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Джин редактирования зависит от дозы-при режиссёром RNP и ssODN. Синхронизированы и выпустила HCT 116-19 клетки были electroporated с 24-120 пмоль ТРИФОСФАТЫ/Cas9 RNP и 0,6-3,0 мкм 72mer. После периода восстановления 72-h ген редактирования деятельность была измерена с помощью проточный цитометр. Джин редактирования отображается как коррекция КПД (%), определяется количество жизнеспособных клеток eGFP позитивных, деленное на общее количество жизнеспособных клеток в популяции. Планки погрешностей изготавливаются из трех наборов данных очки, набранные в течение трех отдельных экспериментов с использованием базовые вычисления стандартной ошибки. Врезные: Редактирование одного агента гена. Джин редактирования активности, режиссер одноцепочечной олигонуклеотида (72NT) в отсутствие RNP комплекс в одинаковых условиях представлена как функция увеличения концентрации. Эта цифра была изменена с Ривера-Торрес, н. и др. (2017). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. Экспериментальная стратегия для изоляции одной ячейки клонов. Клетки, экспонируется eGFP выражения были забил как позитивный и сортируются с помощью проточный цитометр как отдельные клетки в индивидуальные добра клоновых расширения. Клетки, отсутствует выражение eGFP были изолированы и сортируются по аналогии и расширена на тех же условиях. ДНК был затем изолированы и eGFP ген был усилен и подвергнут Сэнгер последовательности для анализа гена редактирования активность вокруг целевого сайта. Эта цифра была изменена с Ривера-Торрес, н. и др. (2017). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4. (A) аллельные анализ eGFP положительных клеток расширилась как клоновых населения. Клонально изолированы и расширенной eGFP позитивных образцов (шестнадцать клоны) были проанализированы на сайте, связанные с целевой базой и ДНК от каждого, собирают, очищенный, усиливается и виртуализации. Аллельные был проведен анализ с использованием Сэнгер виртуализации, собраны с использованием программного обеспечения визуализации последовательности и по сравнению с последовательности аллеля wildtype, которая показана в верхней части фигуры. Вырезать сайт комплекса RNP обозначается как небольшой черной стрелки, расположенные на зеленый бар (2C crRNA). (B) Аллельные анализ eGFP отрицательные клетки расширилась как клоновых населения. Пятнадцать отдельные образцы, расширена от клонов, возникая от нескорректированной населения, были случайно выбраны и проанализированы для формирования indel на сайте вокруг целевой нуклеотидов. Как выше, аллельные был проведен анализ с использованием Сэнгер секвенирования и собраны с использованием программного обеспечения визуализации последовательности. Опять же последовательность аллеля wildtype в верхней части рисунка, наряду с вырежьте сайт RNP, представлены. Эта цифра была изменена с Ривера-Торрес, н. и др. (2017). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Джин редактирования возникла как основной научной дисциплины главным образом из-за появления ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы. Этот замечательный путь, который облегчает приемных иммунитета в бактериальных клетках, были многоцелевых как молекулярные инструмента, позволяющего геномных изменений в хромосомы человека. Естественной функции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 является отключение вирусной ДНК путем введения двуцепочечные разрывы ДНК приводит к фрагментации30,31. Эта деятельность приводит к разрушению вторжение экзогенной ДНК и приводит к прокариот иммунитета, который подавляет последующего заражения же вирусные частицы. Удивительно эта система демонстрирует легочной поведение, в том, что он может активизировать конкретные gRNA ТРИФОСФАТЫ, созданный предыдущей инфекции события.

Эффективность и точность разрушения гена, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 был использован в многочисленных эукариотических генетических системах где цель заключалась в том, чтобы отключить функционирующий ген32,33. При уменьшении его базального уровня процесс состоит из двух основных этапов. Во-первых, двунитевая перерыв, в то время как вторая опирается на присущие процессу не гомологичных конца присоединения (NHEJ) для завершения нокаут. В большинстве случаев, двунитевая перерыв результаты в создании туп законченному, отвлеченных хромосомных сегментов и ферментов, участвующих в NHEJ реагировать на хромосомные перерыв и действовать конъюнкцию сломанной заканчивается. Иногда этот процесс может включать потери отдельных нуклеотидов в разъединенных сайта. Потеря даже несколько баз могут привести к фреймшифт, и функциональных выражение прекращается. Использование ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для создания генетический нокаут путем привлечения естественный процесс NHEJ революционизировал генетики эукариот; предсказуемые и ожидаемые потери ДНК на целевом сайте.

В отличие от Нокаут гена ряд исследователей занимались пытается перенаправить и перепрофилировать ТРИФОСФАТЫ/Cas9 деятельности к процессу гомологии направленных ремонта. Цель исследования — Джин коррекции. В этой стратегии ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в сочетании с шаблоном доноров ДНК, которая содержит генетическую информацию для восстановления врожденных ошибка или вставить мутации в здоровых генов. Ранние подсветка ТРИФОСФАТЫ/Cas9 замечательную способность катализировать гомологии направленных ремонт сообщениям (прямо или косвенно) что процесс произошел в высокоточных моды24,34. Наша лаборатория занимается изучением гомологии направленных ремонт или гена коррекции с помощью одноцепочечной олигонуклеотиды в попытке определить механизм и регулирования цепь вокруг него15,17,18 ,23. Мы были сосредоточены главным образом на ген редактирования точечные мутации, так как это самые основные генетические мутации, известно, что ответственность за многих наследственных заболеваний. Наши фундаментальные знания гена редактирования привели нас поставить под сомнение точность ТРИФОСФАТЫ/Cas9 активности в этих реакциях, поскольку функция ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в результатах Нокаут гена в формировании indels. Мы использовали систему четко определенной модели, а не non дискретные еще клинически значимых генов, для изучения на месте мутагенеза в явно редукционистской моды. С помощью простой целевого гена, после которых ген коррекции может быть измерена как генотипические и фенотипические уровнях, мы полагали, что неоднородность, происходящих на целевом сайте могут быть определены в надежные и достоверные моды.

Наши данные подтверждают, что устоявшихся гена, редактирования системы, состоящий из мутантов eGFP гена, интегрированы в HCT116 клетки, может предоставить фундаментальные информацию относительно поколения процесса на месте мутагенеза и генетических повреждений. Молекулы ДНК ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и одноцепочечной олигонуклеотида доноров, работающих в тандеме может привести к точной ремонт Точечная мутация в гене eGFP. Мы предлагаем новую модель для ремонта точечные мутации, молекулярные пути, в котором доноров ДНК, действует как шаблон репликации для ремонта базу мутант, процесс, мы называем точной30. Целевой группы населения, не экспонируется исправленные фенотипа, отображает различные клетки, содержащие разнородные и широко начиная indels ДНК, окружающих целевого сайта. В примерно половина клоны, изолированных от нескорректированной населения удаление мутагенеза наблюдалось на целевом сайте. Поскольку нет предыдущего доклада указывалось, что одноцепочечной олигонуклеотиды, действуя как сингл агент гена-инструменты для редактирования может вызвать indels на целевом сайте, мы заключаем, что активность ТРИФОСФАТЫ/Cas9 несет ответственность за эти мутации.

В этой рукописи мы предоставляем подробную методологию, так что генетической гетерогенностью на целевой сайт может быть измерена в надежные и достоверные моды. Хотя огромное количество внимания было уделено анализу и картирование внеофисной мутагенеза, вполне вероятно, что разнородные мутации, созданный на конечном сайте будет иметь большее влияние на успех или провал гена, редактирования в сфере клинических. Дополнительные технологии или модифицированных Cas9 белки могут потребоваться для повышения точности гомологии направленных ремонт врожденных mammalian клеток35. Некоторые из этих технологий включают в себя использование вспомогательных олигонуклеотиды действовать в качестве моста, держа хромосомных концы вместе и избежать разрушительного действия NHEJ. Определение степени неоднородности на целевой сайт в результате редактирования гена деятельности является и должна быть важной частью любой протокол, разработанный для терапевтического вмешательства.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы имеют без подтверждений.

Materials

McCoy’s 5A Modified medium ATCC 30-2007
Fetal Bovine Serum (FBS) ATCC 30-2020
L-glutamine ATCC 30-2214
Penicillin-Streptomycin Solution ATCC 30-2300
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ATCC 30-2200 No Calcium or magnesium
Trypsin EDTA Solution ATCC 30-2101
Aphidicolin 1mg Thermo Fisher AC611970010
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol IDT No catalog number since its made to your specific gene target.
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol IDT 1072533
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg IDT 1074182
IDTE Buffer IDT 11-01-03-01
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm VWR 10497-474
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems BioRad 1652660
Bovine serum albumin
lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE)		 Sigma 05470-1G
EDTA (0.5 M), pH 8.0 ThermoFisher Scientific AM9260G
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water ThermoFisher Scientific P3566
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69581
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates VWR 10062-892
Petri Dishes Fisher 12-565-90
Conical Tubes (15 mL) (racked) Thermo Fisher AM12500
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Reduced Serum Medium Thermo Fisher 31985062
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  2. Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
  3. Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
  4. Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Génétique. 93, 2071-2076 (1996).
  5. Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
  6. Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
  7. Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
  8. Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
  9. Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
  10. Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
  11. Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
  12. Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
  13. Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
  14. Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
  15. Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
  16. Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
  17. Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
  18. Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
  19. Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
  20. Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
  21. Wang, Z., Zhou, Z. -. J., Liu, D. -. P., Huang, J. -. D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
  22. Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
  23. Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
  24. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  25. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  26. Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a., Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791 (2014).
  28. Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308 (2015).
  29. Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
  30. Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350 (2017).
  31. Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
  32. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  33. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  34. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
  35. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).

Tags

CRISPR/Cas9SsODNOn-site MutagenesisHomology Directed RepairGene CorrectionHTT116 CellsTrypan BlueHemocytometerAphidicolinEGFP GeneGuide SequencesCrRNATracrRNA

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells. J. Vis. Exp. (126), e56195, doi:10.3791/56195 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image