Простой ликвидации фон флуоресценции в формалин Исправлена человеческий мозг ткани для микроскопии иммунофлуоресценции
Summary
Фон аутофлюоресценция биологических образцов зачастую осложняет на основе флуоресценции методы визуализации, особенно в возрасте человека постмитотических тканей. Этот протокол описывает, как можно эффективно удалить аутофлюоресценция из этих образцов использование коммерчески доступных Светоиспускающий диод свет источника в photobleach образце до иммуноокрашивания.
Abstract
Иммунофлюоресценции это общий метод, используемый для визуализации субцеллюлярные отсеков и определить локализацию специфических белков в образец ткани. Большим препятствием для приобретения иммунофлюоресценции изображения высокого качества — эндогенного аутофлюоресценция тканей, вызванных старения пигменты как липофусцин или общих процессов подготовки образцов таких как альдегид фиксации. Этот протокол описывает, как фон флуоресцирования можно значительно сократить через Фотообесцвечивание, с использованием белого фосфора Светоиспускающий диод (LED) массивов до лечения с флуоресцентных зондов. Широкий спектр эмиссии белого фосфора светодиоды позволяют для отбеливания флуорофоров по целому ряду пики выбросов. Аппарат Фотообесцвечивание могут быть построены из готовых компонентов по очень низкой цене и доступной альтернативой коммерчески доступных химических quenchers. Фотообесцвечивание Предварительная обработка ткани, следуют обычных иммунофлюоресценции пятнать генерирует изображения бесплатно аутофлюоресценция фон. По сравнению создан химических quenchers, которые сократили зонд, а также фон сигналов, Фотообесцвечивание лечения было не влияет на интенсивность флуоресценции зонда, в то время как она эффективно уменьшить фон и липофусцин флюоресценция. Хотя Фотообесцвечивание требует больше времени для предварительной обработки, более высокой интенсивности Светодиодные массивы могут использоваться для уменьшения времени Фотообесцвечивание. Этот простой метод потенциально может применяться в различных тканях, особенно постмитотических тканей, которые аккумулируют липофусцин например мозга и сердечной или скелетных мышц.
Introduction
Микроскопии флуоресцирования, с использованием антител против специфические белки обычно используется для визуализации протеинов интереса в культуре клеток и тканей. Серьезным осложнением на приобретение ясного и окончательного изображения в иммунофлуоресценции, Аутофлюоресценция, которое может быть вызвано эндогенно в тканях млекопитающих возраст пигмент липофусцин и белков эластина и коллагена в1, 2. Другие источники аутофлюоресценция могут быть введены через шаги подготовки образца как альдегид фиксации3. Липофусцин гранул, состоящий главным образом из окислительно модифицированных белков и липидов деградации остатков, накапливаются в Лонг живые клетки с повышенной возраст2. Это вызывает трудности в imaging постмитотических тканей мозга и сердечной или скелетных мышц, как спектр липофусцин флюоресценция выбросов является широкой и переменных, часто совпадает с длиной волны выбросов общей флуорофоров, используется для Маркировка4. Эти факторы делают изображений человеческого мозга ткани от случаев позднего начала нейродегенеративных заболеваний, таких как frontotemporal Лобар дегенерация (FTLD) особенно сложной.
Чтобы уменьшить аутофлюоресценция, мы разработали технику, в которой мы облучить разделов слайд установлен ткани с белым Светоиспускающий диод (LED) массива с использованием бытовых стол лампа5. Этот простой метод предоставляет альтернативу методы, которые используют химические quenchers например CuSO4 в Ацетат аммония, или коммерчески доступных, закалки красителей Судан черный B и Эриохром черный Т6. Она также имеет значительные экономии более многоспектральных привело лампа Фотообесцвечивание методы и избежать осложнений и артефакты, создаваемые цифровой аутофлюоресценция методы удаления как спектральные снимите смешивания7,8. Белый фосфор светодиоды имеют широкий спектр излучения, высокая яркость и низкой стоимости производства, что делает их идеальными как готовый компонент для Фотообесцвечивание различных хромофоры5,9.
В этом протоколе мы продемонстрировать строительство Фотообесцвечивание аппарат, с помощью доступных компонентов и применить Фотообесцвечивание к делу FTLD ткани, содержащие Тау положительных включений (FTLD-T) с использованием антител специфических для фосфорилированных Тау. Мы продемонстрировать влияние Фотообесцвечивание на визуализации дневно обозначенного антитела, используя два часто используемых хромофоры: Alexa 488 и Техас красный. Эффект Фотообесцвечивание по сравнению с необработанной секции или тех, кто лечится коммерческих химических утоления количественно и сравнить. Этот Фотообесцвечивание до лечения могут быть включены в любой стандартный иммунофлюоресценции окрашивание протокол для удаления аутофлюоресценция в биологическом образце.
Protocol
Representative Results
Discussion
Фотообесцвечивание Предварительная обработка тканей, описанные в этой рукописи позволяет для эффективной ликвидации аутофлюоресценция, с использованием готовых компонентов. Протокол описывает иммунофлюоресценции изображений фосфорилированных Тау агрегатов в формалин Исправлена …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано в целом или в части канадского консорциум нейродегенеративные и старения (CCNA), Канадский институт из медицинских исследований (КНИИЗ), ALS общества Канады (ALS Канада) и болезнь Альцгеймера общества Канады (ASC). Авторы хотели бы поблагодарить Султан Darvesh и Эндрю Рид из морской мозга ткани банка для предоставления в ткани мозга FTLD, Милан Гангули от пространственно-временной ориентации и усиление излучения ответ (STTARR) программы и ее аффилированными финансирующие учреждения для ткани встраивание и секционирование служб и расширенный оптической микроскопии фонда (AOMF) для предоставления инструментов микроскопии. Кевин Hadley поблагодарил за критический обзор рукописи.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin . Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al. Human and rat brain lipofuscin proteome. Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
