القضاء بسيطة من الأسفار الخلفية في أنسجة المخ البشري الفورمالين--الثابتة للفحص المجهري الفلورة
Summary
وكثيراً ما يعقد أوتوفلوريسسينسي الخلفية من العينات البيولوجية تقنيات التصوير القائم على الأسفار، لا سيما في الأنسجة بوستميتوتيك البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين. هذا البروتوكول ويصف كيف يمكن إزالة أوتوفلوريسسينسي من هذه العينات فعالية استخدام ضوء متاحة تجارياً التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي المصدر إلى فوتوبليتش العينة قبل إيمونوستينينج.
Abstract
الفلورة الطريقة شائعة المستخدمة لتصور المقصورات سوبسيلولار وتحديد إضفاء الطابع المحلي على بروتينات محددة داخل عينة أنسجة. عقبة كبيرة للحصول على صور ذات جودة عالية الفلورة أوتوفلوريسسينسي الذاتية للأنسجة سبب أصباغ الشيخوخة مثل ليبوفوسسين أو بعينه إعداد العمليات الشائعة مثل التثبيت ألدهيد. ويصف هذا البروتوكول كيف يمكن تخفيض fluorescence الخلفية إلى حد كبير من خلال استخدام الفوسفور الأبيض الضوء التي تنبعث منها صفائف صمام ثنائي (LED) قبل المعالجة مع تحقيقات الفلورسنت فوتوبليتشينج. واسعة الطيف انبعاث الفوسفور الأبيض المصابيح تسمح للتبييض من فلوروفوريس عبر مجموعة من الحدود القصوى للانبعاثات. جهاز فوتوبليتشينج يمكن بناؤها من المكونات الجاهزة تكلفة منخفضة جداً ويوفر بديلاً موجوداً على كوينتشيرس الكيميائية المتاحة تجارياً. فوتوبليتشينج ما قبل معالجة من الأنسجة تليها تلطيخ الفلورة التقليدية يولد الصور خالية من أوتوفلوريسسينسي الخلفية. مقارنة للمنشأة قوينتشيرس الكيميائية التي خفضت التحقيق، فضلا عن خلفية الإشارات العلاج فوتوبليتشينج قد أي تأثير على كثافة fluorescence التحقيق في حين أنها خفضت فعالية الفلورية الخلفية وليبوفوسسين. على الرغم من أن فوتوبليتشينج يتطلب المزيد من الوقت لما قبل المعالجة، يمكن استخدام صفائف الصمام كثافة أعلى للحد من الوقت فوتوبليتشينج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسيط يحتمل أن تكون لمجموعة متنوعة من الأنسجة، ولا سيما بوستميتوتيك الأنسجة التي تتراكم lipofuscin مثل الدماغ وعضلات القلب أو الهيكل العظمى.
Introduction
الأسفار مجهرية باستخدام الأجسام المضادة لاستهداف البروتينات المحددة يستخدم بشكل روتيني أن تصور البروتينات ذات الاهتمام في زراعة الخلايا والأنسجة. مضاعفات رئيسية للحصول على صور واضحة ونهائية في الفلورة هو أوتوفلوريسسينسي، الذي يمكن أن يكون سبب اندوجينوسلي في أنسجة الثدييات lipofuscin الصباغ العمر والبروتينات مثل الايلاستين والكولاجين1، 2. ويمكن إدخال مصادر أخرى من أوتوفلوريسسينسي من خلال خطوات إعداد عينة مثل التثبيت ألدهيد3. حبيبات Lipofuscin، تتكون أساسا من البروتين أوكسيداتيفيلي المعدلة والدهن تدهور المخلفات، تتراكم في الخلايا الحية منذ فترة طويلة مع زيادة السن2. هذا يسبب صعوبات في التصوير بوستميتوتيك الأنسجة مثل الدماغ وعضلات القلب أو الهيكل العظمى، كما طيف انبعاث fluorescence lipofuscin الواسع والمتغير، غالباً ما تتزامن مع الطول الموجي الانبعاثات من فلوروفوريس الشائعة المستخدمة تصنيف4. وهذه العوامل تجعل تصوير أنسجة المخ البشري من حالات الإصابة بأمراض الأعصاب أواخر ظهور مثل انحطاط فصي فرونتوتيمبورال (فتلد) لا سيما تحدي.
للحد من أوتوفلوريسسينسي، وضعنا أسلوب الذي نحن تشعيع أقسام الأنسجة محمولة على الشريحة مع ضوء أبيض التي تنبعث منها مجموعة صمام ثنائي (LED) باستخدام مصباح مكتب منزلية5. يوفر هذا الأسلوب بسيطة كبديل للتقنيات التي تستخدم كوينتشيرس الكيميائية مثل CuSO4 في خلات الأمونيوم، أو المتاحة تجارياً تبريد الأصباغ مثل “السودان ب أسود” و “أسود اريوتشرومي ر”6. كما أنها أكثر فورات كبيرة متعددة الأطياف قيادة مصباح فوتوبليتشينج التقنيات ويتجنب المضاعفات والآثار المتولدة من طرق إزالة أوتوفلوريسسينسي الرقمية مثل الطيفية خلط الأمم المتحدة7،8. الفوسفور الأبيض لها المصابيح أطياف الانبعاث، والإضاءة العالية والتصنيع منخفضة التكلفة، يجعلها مثالية كأحد مكونات جاهزة لمجموعة متنوعة من صباغات5،9فوتوبليتشينج.
في هذا البروتوكول، تثبت بناء جهاز فوتوبليتشينج باستخدام مكونات موجوداً، وتطبيق فوتوبليتشينج على حالة الأنسجة فتلد المحتوية على تاو-إيجابية تضمينات (فتلد-T) باستخدام جسم محددة تاو فوسفوريلاتيد. نظهر تأثير فوتوبليتشينج على تصوير الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي توظيف اثنين من صباغات المستخدمة بشكل شائع: 488 أليكسا وتكساس الأحمر. أثر فوتوبليتشينج مقابل المقاطع غير المعالجة أو تلك التي تعامل مع تقضي المواد كيميائية تجارية كمياً والمقارنة. هذا فوتوبليتشينج قبل العلاج يمكن إدراجها في أي بروتوكول المصبوغة الفلورة القياسية لإزالة أوتوفلوريسسينسي في عينة بيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح بالمعالجة المسبقة فوتوبليتشينج للأنسجة الموصوفة في هذه المخطوطة للقضاء الفعلي على أوتوفلوريسسينسي باستخدام العناصر الجاهزة للاستخدام. وصف البروتوكول تصوير الفلورة المجاميع تاو فوسفوريلاتيد في أنسجة المخ البشري الفورمالين–الثابتة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق 488 ألي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذه الدراسة كلياً أو جزئيا “كونسورتيوم نيوروديجينيريشن الكندي” والشيخوخة (CCNA)، المعهد الكندي للصحة البحوث (استوفوا)، جمعية المرض من المرض (كندا)، وجمعية الزهايمر من كندا (ASC). المؤلف يود أن يشكر سلطان درفش وأندرو ريد من البنك أنسجة الدماغ البحري لتوفير أنسجة المخ فتلد، “ميلان وغانغولي” من البرنامج “تستهدف” الزمانية والتضخيم من الإشعاع استجابة (ستار) ولها المنتسبة تمويل الوكالات للأنسجة التضمين وتمزيقها الخدمات، ومتقدمة بصرية مجهرية مرفق (أومف) لتوفير أدوات الفحص المجهري. وشكر هادلي كيفن هو استعراض نقدي للمخطوطة.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin . Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al. Human and rat brain lipofuscin proteome. Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
