Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência
Summary
Um protocolo detalhado de um modelo de mouse para enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) colonização usando bactérias bioluminescência-etiquetado é apresentado. A detecção destas bactérias bioluminescentes por um não-invasivo na vivo sistema de animais vivos de imagem pode avançar nossa compreensão atual da colonização de EHEC.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157: H7, que é um patógeno de origem alimentar que causesdiarrhea, (HS), a colite hemorrágica e Síndrome hemolítico-urêmica (HUS), colonizar para o trato intestinal de seres humanos. Para estudar o mecanismo detalhado da colonização de EHEC in vivo, é essencial ter modelos animais para monitorar e quantificar a colonização de EHEC. Demonstramos aqui um modelo de colonização de rato-EHEC, transformando o plasmídeo expressando bioluminescente de EHEC para monitorar e quantificar a colonização de EHEC em hospedeiros vivos. Animais inoculados com bioluminescência-rotulado EHEC mostram sinais bioluminescentes intensos em camundongos por detecção com um não-invasivo na vivo sistema de imagem. Após 1 a 2 dias pós infecção, sinais bioluminescentes poderiam ainda ser detectados em animais infectados, o que sugere que o EHEC colonizar em hospedeiros pelo menos 2 dias. Também demonstramos que estes EHEC bioluminescentes localizar de intestino de rato, especificamente no ceco e cólon, de imagens ex vivo . Este modelo de colonização de rato-EHEC pode servir como uma ferramenta para fazer avançar o conhecimento atual do mecanismo de colonização EHEC.
Introduction
EHEC O157: H7 é um patógeno que causa diarreia1, HS2, HUS3e insuficiência renal aguda mesmo4 através de água ou alimentos contaminados. EHEC é um enterobacterium patogênico e coloniza para o trato gastrointestinal dos seres humanos1. Quando EHEC primeiro aderir ao epitélio intestinal do hospedeiro, eles injetam os fatores de colonização em células hospedeiras através do sistema de secreção de III do tipo (T3SS) que funciona como uma seringa molecular induzindo um anexar e apagar (A/E) lesão posteriormente para impor adesão (colonização)5. Estes genes envolvidos na formação da lesão de A/E são codificados pelo locus do enterócito (LEE) de apagamento de ilha de patogenicidade5.
Bioluminescência é uma reação química produzindo a luz, na qual luciferase catalisa sua Luciferina de substrato para gerar luz visível6. Este processo enzimático, muitas vezes, requer a presença de oxigênio ou trifosfato de adenosina (ATP)6. Bioluminescência (BLI) de imagem permite que os pesquisadores a visualização e a quantização das interações patógeno-hospedeiro em animais vivos7. BLI pode caracterizar o ciclo de infecção bacteriana em animais vivos, seguindo as bactérias bioluminescentes que migrar para e invadir tecidos diferentes7; Isto revela uma dinâmica progressão da infecção. Além disso, a carga bacteriana nos animais está relacionada com o sinal bioluminescentes8; assim, é um conveniente indicador para estimar as condições patológicas de animais experimentais em uma maneira simples e direta.
O plasmídeo utilizado aqui contidos o operon do luciferase, luxCDABE, que é a partir da bactéria Photorhabdus luminescens que codifica seu próprio substrato de luciferase7,9. Transformando este plasmídeo luciferase-expressando em bactérias, os processos de colonização e infecção podem ser monitorados, observando estas bactérias bioluminescentes em animais vivos. Em geral, BLI e rotulado de bioluminescência bactérias permitem aos investigadores monitorar os números bacterianos e localização, viabilidade bacteriana com antibióticos/terapia tratamento e expressão de gene bacteriano em infecção/colonização6, 7. numerosas bactérias patogênicas têm sido relatadas que expressam o operon luxCDABE para examinar a sua expressão de ciclo e/ou gene infecção na infecção. Estas bactérias, incluindo uropathogenic e. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropatogênica Escherichia coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, e Vibrio cholerae20, foram documentados.
Vários modelos experimentais foram desenvolvidos para facilitar o estudo da EHEC colonização in vitro e in vivo21,22,23. No entanto, há uma falta de modelos animais apropriados para estudar o EHEC colonização na vivoe, portanto, uma escassez resultante de detalhes. Para facilitar o estudo da EHEC colonização mecanismo na vivo, que é valioso para construir modelos animais para observar e quantificar a colonização de EHEC em animais vivos em um método não-invasivo.
Este manuscrito descreve um modelo de colonização de rato-EHEC que usa um sistema expressando bioluminescente para monitorar a colonização de EHEC ao longo do tempo em hospedeiros vivos. Ratos intragastrically são inoculados com bioluminescência-rotulado EHEC e o sinal bioluminescente é detectado em ratos com um não-invasivo na vivo de imagem de sistema13. Camundongos infectados com bioluminescência-rotulado EHEC mostrou sinais bioluminescentes significativos em seu intestino, depois de 2 dias pós infecção, que sugeriu que essas bactérias colonizaram no intestino hospedeiro após 2 dias pós infecção. Dados de imagem ex vivo mostram que esta colonização é especificamente no ceco e cólon de ratos. Usando este modelo de rato-EHEC, a colonização de EHEC bioluminescente pode ser detectada no hospedeiro vivo por um na vivo de imagem de sistema, para estudar os mecanismos detalhados da colonização de bactérias entéricas, que pode promover uma compreensão mais em EHEC-induzido por alterações fisiológicas e patológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tem sido relatado que EHEC transformada com o plasmídeo luciferase tem sido utilizada para examinar sua localização em hosts ou expressão de gene em vivo8,11,12. O modelo murino demonstrado aqui também tem sido relatado para detectar o sincronismo de EHEC colonizado e localização no anfitrião murino8. Não obstante, nós fornecemos o protocolo de detalhe de como administrar a inoculação…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o Chi-Chung Chen do departamento de pesquisa médica, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) pela ajuda no mouse, infecção e o apoio do centro de animais de laboratório da Universidade Nacional de Cheng Kung. Este trabalho é apoiado pelo Ministro da ciência e tecnologia (a maioria) concede (mais 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) para CC.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
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