זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה
Summary
פרוטוקול מפורט של דגם העכבר עבור enterohemorrhagic e. coli (EHEC) מושבת באמצעות חיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה מוצג. זיהוי חיידקים זוהרים אלו באמצעות פולשני ויוו מערכת בבעלי חיים הדמיה יכול לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של EHEC קולוניזציה.
Abstract
Enterohemorrhagic e. coli (EHEC) O157:H7, אשר הוא. חיידק והקאה causesdiarrhea הזה, מדמם קוליטיס (HS), ו תסמונת אורמיה hemolytic (HUS), ליישב את העיכול של בני אדם. ללמוד מנגנון מפורט של EHEC קולוניזציה ויוו, זה חיוני כדי להיות מודלים בעלי חיים כדי לפקח ולכמת EHEC קולוניזציה. נדגים כאן מודל קולוניזציה העכבר-EHEC בהפיכת את פלסמיד לביטוי זוהרים כדי EHEC כדי לפקח ולכמת כיבוש EHEC חי המארחים. בעלי חיים מחוסן עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC להציג אותות ביולומנאסן אינטנסיבי בעכברים על-ידי זיהוי עם יישום לא פולשנית ויוו מערכת הדמיה. לאחר ימים 1 ו-2 פוסט זיהום, אותות ביולומנאסן יכול עדיין ניתן לאתר חיות נגועות, מה שמרמז כי EHEC לישוב ב hosts לפחות 2 ימים. אנחנו גם להוכיח כי אלה EHEC ביולומנאסן לאתר כדי העכבר המעי, בפרט המעי האטום ואת המעי הגס, מתמונות vivo לשעבר . מודל מושבת זה עכבר-EHEC עשוי לשמש כלי לקידום הידע הנוכחי של מנגנון קולוניזציה EHEC.
Introduction
EHEC O157:H7 הוא. חיידק הגורם לשלשול1, HS2, הוס3ואי ספיקת כליות חריפה אפילו4 דרך מזון או מים מזוהמים. EHEC enterobacterium פתוגניים, והצנרות מערכת העיכול של בני אדם1. כאשר EHEC לדבוק קודם אפיתל המעי המארח, הם מזריקים את הגורמים קולוניזציה לתוך התאים המארחים דרך סוג III הפרשת מערכת (T3SS) כי פונקציות כמו מזרק מולקולרית בתדר של הצמדת ו effacing (A/E) הנגע לאחר מכן כדי לאכוף אדהזיה (מושבת)5. אלה גנים המעורבים במערך A/E הנגע מקודדים על ידי מיקומה של האי פתוגניות הצטנעות (לי) enterocyte5.
הארה ביולוגית היא לייצר אור תגובה כימית, ב לוציפראז אשר מזרז luciferin המצע שלה כדי ליצור אור גלוי6. תהליך אנזימטי זה לעיתים קרובות דורשת הנוכחות של חמצן או אדנוזין טריפוספט (ATP)6. ביולומינסנציה הדמיה (בלי) מאפשר חוקרים את הפריט החזותי ו קוונטיזציה של פתוגן-פונדקאי אינטראקציות ב בעלי חיים7. מתה על ניתן לאפיין את מחזור זיהום חיידקי בבעלי חיים על ידי ביצוע חיידקים זוהרים כמו שהם להגר לפלוש לרקמות שונות7; זה מגלה שינוי דינמי של זיהום. יתר על כן, העומס חיידקי בבעלי חיים קשורה האות ביולומנאסן8; לכן, יש חיווי נוח כדי להעריך את התנאים פתולוגי של חיות ניסוי באופן פשוט וישיר.
פלסמיד המשמש כאן הכיל את אופרון לוציפראז, luxCDABE, שבו הוא מן החיידק Photorhabdus luminescens מקודד משלו לוציפראז המצע7,9. על-ידי שינוי צורה זו פלסמיד לבטא לוציפראז לתוך חיידקים, ניתן לנטר את התהליכים קולוניזציה ולדלקת על ידי התבוננות חיידקים זוהרים אלו בבעלי חיים. בסך הכל, בלי וחיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה לאפשר לחוקרים לעקוב אחר המספרים חיידקי, למיקום, הכדאיות חיידקי עם אנטיביוטיקה/טיפול, ביטוי גנים חיידקיים זיהום/מושבת6, 7. חיידקים פתוגניים רבים דווחו כי לבטא את אופרון luxCDABE לבחון זיהום מחזור ו/או גנים ביטוי במעשים זיהום. חיידקים אלה, כולל e. coliuropathogenic10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic e. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, סלמונלה typhimurium16, ליסטריה17,18, Yersinia enterocolitica19, , ויבריו cholerae20, תועדו.
מספר גרסאות ניסיוניות פותחו כדי להקל על המחקר של EHEC קולוניזציה במבחנה , ויוו21,22,23. עם זאת, יש חוסר מודלים מתאימים ללמוד את EHEC קולוניזציה ויוו, ובכך וכתוצאה מכך במחסור של פרטים. כדי להקל על המחקר של ה EHEC קולוניזציה מנגנון ויוו, זה חשוב כדי לבנות מודלים בעלי חיים כדי להתבונן ולכמת EHEC קולוניזציה בבעלי חיים בשיטה לא פולשנית.
כתב יד זה מתאר מודל קולוניזציה העכבר-EHEC משתמש במערכת לביטוי זוהרים כדי לפקח EHEC קולוניזציה לאורך זמן ב חי המארחים. עכברים intragastrically מחוסנים עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC ומתגלה האות ביולומנאסן בעכברים עם יישום לא פולשנית ויוו הדמיה מערכת13. עכברים נגועים עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC הראה אותות ביולומנאסן משמעותי במעי שלהם לאחר יומיים לפרסם זיהום, אשר הציע כי חיידקים אלה התנחלו במעי המארח לאחר יומיים לפרסם זיהום. Ex-vivo נתוני התמונה הראה כי קולוניזציה הזה הוא במיוחד ב המעי האטום ואת המעי הגס של עכברים. באמצעות מודל זה עכבר-EHEC, הקולוניזציה EHEC ביולומנאסן ניתן להבחין במארח החיים של ויוו מערכת, כדי לחקור את המנגנונים מפורט מושבת בה חיידק, אשר עשוי לקדם הבנה נוספת בהדמיה EHEC-induced פיזיולוגיים ופתולוגיים שינויים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבר דווח כי יש כבר מנוצל EHEC טרנספורמציה עם פלסמיד לוציפראז לבחון שלה לוקליזציה מארחים או גנים ביטוי ויוו8,11,12. המודל מאתר המודגמות כאן דווחה גם לזהות את העיתוי EHEC התנחלו ולוקליזציה מארח מאתר8. עם זאת, אנו מספקים פרוטוקול …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו להכיר את צ’י-צ’אנג צ’ן מן המחלקה של מחקר רפואי, המרכז הרפואי של מיי צ’י (איחוד האמירויות הערביות) על העזרה עכבר, זיהום, והתמיכה מהמרכז חיות מעבדה של האוניברסיטה הלאומית צ’נג קונג. עבודה זו נתמכת על ידי שר המדע, הטכנולוגיה (רובם) מעניקה (ביותר 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) CC.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
References
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90 (2012).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
- Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
- Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
- Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. . Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
- Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82 (2016).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
- Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
- Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
- Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
- Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
- Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977 (2013).
- Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013 (2014).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
- Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud’homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
- Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
- Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
- Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).
