تقييم كثافة المشبك في الدماغ القوارض هيبوكامبال شرائح
Summary
هو بروتوكول لدقة تحديد وتحليل نقاط الاشتباك العصبي في شرائح هيبوكامبال استخدام الفلورة الموضحة في هذه المقالة.
Abstract
في الدماغ، وهي الاشتباكات العصبية المتخصصة الوصلات بين الخلايا العصبية، تحديد قوة وانتشار الإشارات العصبية. وينظم العدد من الاشتباكات العصبية محكم أثناء تطوير ونضوج الخلايا العصبية. الأهم من ذلك، يمكن أن يؤدي العجز في عدد المشبك إلى الخلل المعرفي. لذلك، يتم تقييم عدد المشبك جزءا لا يتجزأ من علم الأعصاب. ومع ذلك، كما نهايات صغيرة وصغيرة جداً في الدماغ سليمة، تقييم العدد المطلق التحدي. ويصف هذا البروتوكول وسيلة تحديد وتقييم نقاط الاشتباك العصبي هيبوكامبال شرائح القوارض باستخدام مجهر الفلورة بسهولة. ويشمل إجراء ثلاث خطوات لتقييم نقاط الاشتباك العصبي في صور المجهر [كنفوكل] عالية الجودة من خلال تحليل التعريب المشارك من البروتينات قبل وبوستسينابتيك في شرائح هيبوكامبال. كما توضح هذه المقالة كيف يتم إجراء التحليل ويعطي أمثلة من نهايات كل ضادات والمثبطة. هذا البروتوكول يوفر أساسا صلبا لتحليل نقاط الاشتباك العصبي، ويمكن تطبيقها على أي بحث التحقيق في هيكل ووظيفة المخ.
Introduction
المخ البشري يتكون من حوالي 1014 نقاط الاشتباك العصبي. وينظم عدد المشبك محكم أثناء تطوير ونضوج الجهاز العصبي المركزي (CNS). في التنمية، وهو التضمين عدد المشبك سينابتوجينيسيس والتقليم لتشكيل الشبكات العصبية الوظيفية. التعلم والذاكرة معتمدة من اللائحة رقم المشبك وقوة، وعملية تعرف بالتقوية متشابك والاكتئاب1. الأهم من ذلك تحقيق الاستقرار في نهايات ناضجة ضروري للحفاظ على اتصالات الشبكة العصبية. وعلاوة على ذلك، أبلغ عن العجز في كثافة المشبك في المراحل الأولى من حالات الأعصاب مثل مرض الزهايمر (AD)2. ولذلك، القدرة على دقة تحديد وتقييم عدد المشبك أمر أساسي لتقييم فسيولوجيا الدماغ وعلم الأمراض.
الكثافة القصوى وضغط طبيعة الاشتباكات العصبية تجعل من التحدي لتقدير العدد الدقيق في مناطق الدماغ سليمة. الاشتباكات العصبية الكيميائية في الجهاز العصبي المركزي مصنوعة من اثنين من الخلايا العصبية في ترخيصات الوثيق، مفصولة بشق متشابك3. المحطة الطرفية قبل متشابك، أو بوتون متشابك، يخرج من إكسون وتتكون من حويصلات المتراكمة، التي تحتوي على أجهزة الإرسال العصبية التي تحدد خصوصية المشبك – هما غلوتامات وغاما – حمض أمينوبوتيريك (GABA) ضادات و المثبطة synapses، على التوالي. تحتوي أغشية الحويصلات حويصلية الناقلين محددة لكل ناقل عصبي: غلوتامات حويصلية الناقل (فجلة) الغلوتامات والناقل غابا حويصلية (فجأت) لغابا. المحطة الطرفية بعد متشابك بنية كثيفة جداً يتألف من البروتينات المتعددة، بما في ذلك مستقبلات والتصاق جزيئات البروتينات السقالة. في نهايات عليه، بعد متشابك الكثافة–95 البروتين (مديرية الأمن العام-95) هو الأكثر وفرة سقالة البروتين4، تحوير N-methyl-D-aspartate(NMDA-) عليه ومستقبلات حمض α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (امبا) وظيفة، بينما جيفيرين المراسي المستقبلات المثبطة ل المحطة الطرفية بعد متشابك المثبطة5. إجمالاً، المعونة خصوصية البروتينات إلى ما قبل وما بعد متشابك الأجزاء الأخرى في التمايز وتحديد الأنواع الفرعية المشبك.
يمكن إجراء التقييم لعدد المشبك مع تقنيات مختلفة. الأكثر شيوعاً هو استخدام الميكروسكوب الإلكتروني (م)، الذي يتيح تحليل المشبك في مجالات الاتفاق وسليمة في الدماغ مع تضخم عالية والقرار. ومع ذلك، هذا الأسلوب مكلفة للغاية ويتطلب إعداد نماذج معقدة، ويستغرق وقتاً طويلاً جداً. وتشمل التقنيات الأخرى استخدام صفيف التصوير المقطعي6، الذي لديه عيب رئيسي في أنه يتطلب معدات متخصصة ومكلفة لإجراء التحليل. وعلاوة على ذلك، المعدلة وراثيا خطوط معربا عن علامات متشابك محددة مفيدة في تقييم المشبك رقم7، ولكن توليد خطوط جديدة يمكن أن تكون تقييدية ومكلفة، وقد يؤدي overexpression البروتينات غير المرغوب فيها خارج الهدف تعمل.
بسبب هذه القيود، والبساطة، تقييم العديد من الباحثين عدد المشبك بفحص مستويات البروتين الكلي متشابك. ومع ذلك، يمكن ملاحظة خسارة المشبك قبل إجراء تغييرات كبيرة في البروتين، كنتائج يعيد متشابك الهيكلية في تشتت ترخيصات قبل أو بعد متشابك، مع لا تدهور البروتينات متشابك. وعلاوة على ذلك، هي مستويات البروتين متشابك في الإعلان، انخفاض تنكس المشبك التالية أو موت الخلايا العصبية8،9. التحديد الكمي للمستويات الإجمالية لا تمكن هذا التمييز. وبالتالي، هناك حاجة تطوير طريقة موثوقة وموجودا، ودقيقة لتقييم عدد المشبك في الدماغ.
في هذه المقالة، نحن تصف كيفية تحديد دقة وتحديد العدد من نقاط الاشتباك العصبي باستخدام مجهر الفلورة في شرائح هيبوكامبال الدماغ القوارض. الاشتباكات العصبية تحددها كولوكاليزيشن علامات ما قبل وما بعد متشابك التي تظهر في توزيع الشروريه. ونحن تثبت صحة هذا الأسلوب من خلال دراسة Wnt الإشارات في الدماغ. Wnts بروتينات يفرزها هام لتشكيل والقضاء، والمحافظة على نقاط الاشتباك العصبي. تقلد في فيفو خصم يفرز من تتالي Wnt، ديككوبف-1 (Dkk1)، يؤدي إلى فقدان متشابك ضادات مع الحفاظ على الاشتباكات العصبية المثبطة في الحصين10. علينا توضيح هوية وعدد من الاشتباكات العصبية ضادات والمثبطة في شرائح هيبوكامبال من ماوس الكبار التعبير عن Dkk1 وتسليط الضوء على إمكانية تحويل هذه التقنية إلى أنواع أخرى من الأنسجة/ثقافة الأعمال التحضيرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التقييم الدقيق لعدد المشبك أمر ضروري في مجال علم الأعصاب. وهنا نعرض كيفية تقييم كثافة الاشتباكات العصبية في منطقة CA1 رادياتوم طبقة من شرائح هيبوكامبال كنظام نموذجي. ويتجلى في المادة البحوث الأخيرة على الأثر نقص Wnt في قرن آمون وحيث أننا أيضا تقييم عدد المشبك أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة مقطع واحد-م10. حجم الخسارة المشبك متشابهة بين واحد-قسم طب الطوارئ والدماغ-الشريحة الأسلوب الموصوفة هنا10. وهكذا، يوضح هذا الاستنتاج بدقة وموثوقية تقنية.
الأهم من ذلك، هو حد من واحد-قسم طب الطوارئ والاشتباكات العصبية إيمونوستينينج، كما عرضت هنا، عدم القدرة على دقة تقدير عدد المشبك المطلق لمنطقة معينة من الدماغ. في الواقع، من المهم تحديد أية تغييرات مورفولوجية العالمية، كما يمكن أن تؤثر التغيرات في حجم إجمالي عدد متشابك. قيد آخر أن بعض الأجسام المضادة أقل كفاءة في تلوين المناطق الدماغ سليمة، جزئيا بسبب كثافة الاتصالات متشابك المتطرفة. عانينا من تلطيخ جودة أعلى من vGlut1 وجيفيرين استخدام هذا إعداد شريحة واللاحقة PFA التثبيت بحد أقصى 1 إتش، مقارنة بالتثبيت الفوري لكامل الدماغ في منهاج عمل بيجين (الشكل 2). هذا الأخير أدى إلى تلطيخ متشابك تحبب خفيف، مع ثقوب في الأنسجة. ومع ذلك، لا يزال مقيد باختراق جسم vGlut1 في كلتا الطريقتين (بضع عشرات من ميكرون). لم نتغلب على هذا القيد، حتى مع زيادة جسم الحضانة، ولكن توفير اختراق جسم أكبر من عمق الإجمالية التي يتم تصويرها، ينبغي أن يكون هناك أي تأثير على النتيجة النهائية. وعلاوة على ذلك، ينبغي إيلاء عناية خاصة لضمان أن تلطيخ حتى خلال المكدس المكتسبة بأكملها.
وفي دراستنا، أردنا أن يميز ضادات من الاشتباكات العصبية المثبطة. ونتيجة لذلك، اخترنا vGlut1/مديرية الأمن العام-95 وفجأت/جيفيرين، على التوالي، كما أن هذه البروتينات يتم التعبير عن درجة عالية في قرن آمون الماوس الكبار وهي محددة لكل نوع فرعي المشبك4،5. علامات أخرى متشابك ضادات والمثبطة يمكن أن تستخدم لتحديد كل المشبك كل منها، مثل مستقبلات أثري في كل المشبك، بما في ذلك مستقبلات NMDA وامبا ضادات ومستقبلات جابا للاشتباكات العصبية المثبطة. يمكن أيضا تحديد العصبية أو نيورومودولاتورس أخرى مع بروتوكول لدينا، وضمان أن الأجسام المضادة المحددة متوفرة، كما هو موضح لنهايات تتميز في المخطط22. وبالإضافة إلى ذلك، تقليل سمك كل شريحة إلى 120 ميكرون جزئيا يمكن التغلب على كمية منخفضة من العينات التي تم الحصول عليها مع شرائح الحادة، التي لا بد للدراسات في هياكل الدماغ الصغيرة مثل اللوزة.
التطبيقات المستقبلية لأن البروتوكول يمكن أن تنفذ في دراسة مناطق الدماغ المختلفة والاضطرابات. على سبيل المثال، يمكن استخدام مزيج من vGlut2/مديرية الأمن العام-95 أو vGlut1/مديرية الأمن العام-95 في المخطط (منطقة الدماغ المرتبطة بمرض باركنسون)، للتفريق بين نهايات ضادات من أفيرينتس القادمة من اللحاء أو المهاد، على التوالي22.
وفي الختام، أننا أظهرنا طريقة موثوقة لفحص العدد من الاشتباكات العصبية في أنسجة الدماغ باستخدام علامات ما قبل وما بعد متشابك لتعريف المشبك. وتشمل الخطوات الحاسمة إعداد شرائح هيبوكامبال جيدة، وقت تثبيت ليصل إلى 1 ح في منهاج عمل بيجين، وتطبيق ما يكفي المتوسطة تصاعد، استخدام الأجسام المضادة يمكن الاعتماد عليها، وإعدادات اقتناء الصورة المناسبة، والكشف بونكتا متشابك الصارمة. وفي نهاية المطاف، هذا الأسلوب هو سريعة نسبيا وهو استنساخه بسهولة بأي المختبرات التي يمكنها الوصول إلى مجهر [كنفوكل].
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل لجنة نهر الميكونج والاتحاد الأوروبي FP7، عراك، مؤسسة ويلكوم ترست، والمملكة المتحدة باركنسون. كما نود أن نشكر السيدة جوانا بوتشلير لمساهمتها صور [كنفوكل] والأعضاء من مختبر لمساهماتهم البناءة على المخطوط ومنهجية.
Materials
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
- Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
- Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).
- Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
- Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
- Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer’s disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
- Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
- Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer’s disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
- Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).
- Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
- Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
- Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
- Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer’s brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
- De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
- Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer’s disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
- Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
- Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
- Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
- Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302 (2015).
- Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).
- Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
- Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992 (2014).
