Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения
Summary
В этом протоколе содержится инструкция для образцов отрицательного окрашивания вирусов, которые могут быть легко использованы в лабораториях BSL-2, -3 или -4. Он включает в себя использование инновационной капсулы для обработки, которая защищает сетку электронной микроскопии трансмиссии и обеспечивает удобство работы пользователя в более бурных средах в рамках биоконцентрации.
Abstract
Передаточная электронная микроскопия (TEM) используется для наблюдения ультраструктуры вирусов и других микробных патогенов с нанометровым разрешением. Большинство биологических материалов не содержат плотных элементов, способных рассеивать электроны для создания изображения; Поэтому требуется отрицательное пятно, которое помещает плотные соли тяжелых металлов вокруг образца. Чтобы визуализировать вирусы в суспензии под ТЕМ, их следует наносить на небольшие сетки, покрытые прозрачной поверхностью толщиной всего нанометров. Из-за их небольшого размера и хрупкости эти решетки трудно обрабатывать и легко перемещать воздушными потоками. Тонкая поверхность легко повреждается, оставляя образец трудным или невозможным для изображения. Инфекционные вирусы должны быть обработаны в шкафу для биобезопасности (BSC), а некоторые требуют лабораторной среды для биоконцентрации. Окрашивание вирусов на уровнях биобезопасности (BSL) -3 и -4 особенно сложно, поскольку эти среды более бурные и требуются технические специалисты tO носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), что снижает ловкость.
В этом исследовании мы оценили новое устройство, помогающее отрицательным окрашивающим вирусам в биоконцентрации. Устройство представляет собой капсулу, которая работает как специализированный наконечник пипетки. Когда сетки загружаются в капсулу, пользователь просто отсасывает реагенты в капсулу, чтобы доставлять вирус и пятна в инкапсулированную сетку, тем самым устраняя обработку пользователем сеток. Хотя этот метод был разработан специально для использования в биологическом обогащении BSL-3 или -4, он может облегчить подготовку проб в любой лабораторной среде, обеспечивая легкое отрицательное окрашивание вируса. Этот же метод может быть также применен для получения отрицательно окрашенных образцов ТЕМ наночастиц, макромолекул и аналогичных образцов.
Introduction
Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕА) является эффективным инструментом для просмотра морфологии и ультраструктуры биологических образцов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть с помощью обычного светового микроскопа 1 , 2 , 3 , 4 . TEM снимают электроны через очень тонкий образец, создавая изображение с более высоким разрешением, поскольку электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем свет. Регионы образца, которые изгибают или блокируют электроны, выглядят темными, а области, которые являются электронно-лучистыми, кажутся белыми.
Отсутствие электронного плотного вещества затрудняет просмотр вирусов при ТЭМ, поскольку они не могут рассеивать электроны. Отрицательное окрашивание является наиболее распространенным методом, используемым для создания контраста и просмотра вирусов с помощью TEM. Первая отрицательная процедура окрашивания была предложена Бреннером и Хорном в 1959 году на основе эксперимента, в котором Холл (1955) и Хаксли (1957) наблюдалиПривело к появлению биологических структур в обратном контрасте при погружении в электронно-плотное вещество 5 . Процесс отрицательного окрашивания практически не изменился за последние полвека. Отрицательное окрашивание включает кратковременное применение раствора соли тяжелых металлов к образцу на сетке ТЕА в попытке окружить вирус плотным материалом без проникновения вируса 6 . Это создает темную границу и показывает форму частицы 5 . В этом исследовании используются два реагента для отрицательного окрашивания, уранилацетат (UA) и фосфовольфрамовая кислота калия (PTA). Оба эти пятна обычно используются для негативного окрашивания небольших биологических образцов, таких как вирусы, белковые комплексы и наночастицы 7 , 8 , 9 .
Традиционная технология отрицательного окрашивания – это технология ручного отрицательного окрашивания капельNique 7 . Этот метод требует точной обработки небольших хрупких сеток ТЕА с помощью щипцов для нанесения небольшого количества образца вируса, пятен и полосканий. Типичный протокол подготовки включает в себя нанесение капельки суспензии образца на поверхность сетки ТЕА, покрытой пленкой ( рис. 1А ). После прикрепления образца к поверхности пленки сетку промывают для удаления неадгезивных вирусов и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до минуты, в зависимости от типа образца. Избыточная жидкость отходит от сетки, прикоснувшись к куску фильтровальной бумаги к краю сетки.
Метод ручной капли требует, чтобы каждая сетка была индивидуально изготовлена. Если не обрабатывать тщательно, покрытые сетки ТЕА легко проколоты, согнуты или загрязнены. Обработка нескольких выборок может привести к затруднениям в отслеживании сеток и обеспечении согласованного окрашивания для каждого образца. Эта процедура окрашивания вручную намного больше d(BSL) -3 и -4 лаборатории по биоконцентрации, из-за необходимого средства индивидуальной защиты (СИЗ), необходимого для этих сред. СИЗ громоздка, а окружающая среда биоконцентрации гораздо более бурная по сравнению с обычной лабораторией. Персонал, работающий в лабораториях по биологическому обогащению BSL-3, должен носить 2 пары перчаток и работать в шкафу для биобезопасности (BSC). Этот двойной слой перчаток снижает тактильную чувствительность и ограничивает тонкое движение мотора. Воздушный поток BSC, который защищает пользователя и помогает предотвратить загрязнение образца, может привести к тому, что образцы и пятна высохнут слишком быстро, что повлияет на качество пятен. Сильный турбулентный поток воздуха в BSC также может быстро сдуть сетку, которая недостаточно хорошо закреплена. В лабораториях по биологическому обогащению BSL-4 существуют дополнительные требования безопасности. Персонал должен носить костюм с положительным давлением, который дополнительно ограничивает физическое перемещение и способность четко видеть и манипулироватьUlate. Техник, работающий в BSL-4, также носит по крайней мере 2 пары перчаток, а внешняя пара – толстая перчатка, которая значительно снижает ловкость и осязание. Наконец, щипцы, используемые для работы с сетками ТЕА, являются острыми, что создает риск для техников из-за их способности проколоть перчатки. С капсулами, содержащими сетки, щипцы не нужны, тем самым обеспечивая безопасную альтернативу без использования щипцов для манипулирования сетками в биоконцентрации. Наконец, капсулы также обеспечивают эффективный способ хранения сеток во время обработки, дезактивации пара осмия и во время хранения; Тем самым сохраняя сетки организованными и безопасными от повреждений.
В этом отчете мы вводим новый метод для отрицательных окрашивающих сеток ТЕА в лабораториях по биологическому обогащению, в которых используются капсулы mPrep / g, капсульное устройство для обработки сетки и окрашивания 10 , 11 , 12 . Капсула вмещаетИзменяет две сетки ТЕА, сводит к минимуму прямую обработку и уменьшает вероятность повреждения сетки. Капсула прикрепляется непосредственно к одной или многоканальной пипетке таким же образом, что и наконечник пипетки, что позволяет применять различные жидкости к сеткам, содержащимся внутри. Это позволяет одновременно подготовить несколько образцов с дублирующими сетками ( рис. 1B ). К отрицательному пятну с капсулами образец вируса аспирируют в капсулу и выдерживают в течение 10 минут, чтобы вирусы адсорбировались на поверхности сетки. Затем сетки с адсорбированным вирусом промывают деионизированной (dI) водой и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до 1 мин. Этот процесс использует те же самые этапы и реагенты протокола, что и метод ручной капли; Разница в том, что вся работа происходит внутри капсулы без физической обработки сеток. ( Фиг.1С , 1D ).
Целью этого исследования было оценить капсулы какНовый метод отрицательного окрашивания образцов вирусов в средах биоконцентрации. В этом исследовании также изучалось качество изображений ТЕА, полученных из двух различных процедур инактивации вирусов: 1) быстрая инактивация, 1% пара тетроксида осмия и 2) 24-процентная инактивация с 2% глутаральдегидом. Оба они проводились с использованием капсул. Наконец, мы оценили два часто используемых отрицательных пятна, UA и PTA, для использования в капсуле. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
Отрицательное окрашивание является ценным методом ТЕА для оценки и калибровки вирусов, белковых комплексов и наночастиц. Классификация протоколов на протяжении более полувека была составлена каплеобразным составом этих образцов путем ручного перемещения сеток от реагента до от?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы выразить признательность и благодарность д-ру Джону Карре и Ровене Шокман за предоставление очищенных нано-VLP Эбола, доктора Раджини Мудхасани за предоставление вируса Чикунгунья и д-ра Чарльза (Джейсона) Шумейкера за предоставление VLP из мышиной лейкемии, выражающих гликопротеины Эболавируса. Мы также хотели бы поблагодарить МАЯ Карла Соффлера за содействие Программе летней стажировки (SIP) и Программе обучения в области науки и техники (SEAP) и доктору Кэтрин Вильгельмсен за обучение в области безопасности лабораторий.
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland, M., Rojkind, Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
