C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

De generatie van cellulaire en subcellular asymmetrische situaties bestaan, zoals de vorming van gepolariseerde membraan domeinen, is van cruciaal belang voor de voedselproductie en de functie van cellen, weefsels en organen¹. Studies over gepolariseerde biogenese van organellen in epithelen blijven een technische uitdaging, omdat wijzigingen in de toewijzing van subcellular componenten in de richting is afhankelijk van meerdere opeenvolgende en samenvallende extracellulaire en intracellulaire signalen die moeilijk te scheiden in de meeste modellen en sterk afhankelijk van het modelsysteem. Het model gepresenteerd hier – de single-gelaagde Caenorhabditis elegans darm – is een weefsel van verfijnde eenvoud. Samen met de eencellige C. elegans uitscheidingsmechanisme canal (zie bijbehorende papier op gepolariseerde biogenese van organellen in het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans )², biedt verschillende unieke voordelen voor de identificatie en kenmerken van moleculen die nodig zijn voor de biogenese van organellen gepolariseerde. De instandhouding van de moleculaire polariteit signalen uit gist aan man maken dit eenvoudige-ongewervelde orgel een uitstekende“in vivo weefsel kamer” om vragen te stellen over de epitheliale polariteit die rechtstreeks verband houden met het menselijke systeem, dat nog steeds veel te is complex dat de visuele dissectie van deze gebeurtenissen op de single cell niveau in vivo.

Hoewel meerdere geconserveerde polariteit signalen van (1) de extracelluar matrix, (2) het plasmamembraan en zijn kruispunten, en (3) de intracellulaire vesiculaire handel geïdentificeerde³, de onderliggende beginselen van hun integratie in het proces van geweest gepolariseerde epitheliale membraan en weefsel biogenese is slecht begrepen⁴. De klassieke eencellige in vivo modellen (e.g.S. cerevisiae en de zygote C. elegans ) hebben bijgedragen bij de vaststelling van de beginselen van gepolariseerde celdeling en anterior-posterior polariteit en kritische hebben geïdentificeerd membraan-geassocieerde polariteit determinanten (de kleine GTPases/CDC-42, de partitionering-defecte PARs)^5,6, maar ze afhankelijk van unieke symmetriebreking signalen (bud litteken, sperma ingang) en gebrek aan junction-beveiligd apicobasal membraan domeinen en, vermoedelijk, de bijbehorende intracellulaire apicobasal sorteren van machines. Onze huidige kennis over de organisatie van de gepolariseerde handel in epitheel, echter berust voornamelijk op zoogdieren 2D monoculturen⁷, die gebrek aan fysiologische extracellulaire en ontwikkelingsstoornissen signalen die standpunten van membraan kunnen wijzigen domeinen en richtingen van mensenhandel trajecten (een overgang van 2D naar 3D in vitro cultuur systemen alleen volstaat om het omkeren van de membraan polariteit in MDCK (Madin-Darby canine kidney) cellen)⁸. In vivo developmental studies over epitheliale polariteit in ongewervelde modelorganismen werden aanvankelijk uitgevoerd in platte epitheel, bijvoorbeeld in de Drosophila melanogaster opperhuid, waar ze de kritische bijdrage geïdentificeerd junction dynamiek voor gepolariseerde cel migratie en cel blad verkeer⁹en endocytotische mensenhandel voor polariteit onderhoud¹⁰. De 3D in vitro en in vivo analyse van lumen morfogenese in tubulaire epitheel in MDCK cellen en in de darm van C. elegans , respectievelijk, onlangs gebleken dat de eis van intracellulaire mensenhandel voor de Novo (apicaal) domein en lumen biogenese en positionering van^11,12,13. De dikte van buisvormige (versus flat) epitheliale cellen is een voordeel voor de 3D analyse van subcellular asymmetrieën aangezien hierdoor een superieure visuele onderscheid van de apicale-lumenal membraan, apico-laterale kruispunten, het laterale membraan, en de standpunten van intracellulaire organellen. Aan deze visuele voordelen, de C. elegans model voegt de in vivo instelling developmental as, transparantie, eenvoud van lichaam plan, invariant en gedefinieerde cel bloedlijn, analytische (genetische) en extra voordelen die hieronder worden beschreven.

C. elegans zelf is een rondworm van buisstructuur waarvan transparantie en eenvoudige architectuur zijn eveneens buisvormige interne organen direct toegankelijk voor de visuele analyse van buis en lumen morfogenese maken. De twintig cellen van de darm (soms 21 of 22-cellen)¹⁴ zijn afgeleid van een enkele progenitor cel (E) en ontwikkelen van een dubbellaagse epitheel door één bekomt stap in een bilateraal symmetrisch buis van negen INT ringen (vier cellen in de eerste ring; Figuur 1 schematische)^14,15,16. De darm van afkomst en weefsel analyse, in eerste instantie bepaald door Nomarski optica via nucleaire identiteiten¹⁷en later ook door fluorescentie microscopie via gelabelde membranen, heeft kritische inzichten in de voedselproductie, verstrekt in met name de cel-autonome en cel-niet-zelfstandige vereisten voor de directionele celdelingen en bewegingen (bijvoorbeeldbekomt, rechts-links asymmetrieën, anterior en posterior buis rotatie)^14,18 . Vroege endodermal cel specificatie en het gene regelgevende netwerk beheersen van de ontwikkeling van dit orgel klonale model zijn goed gekarakteriseerd^19,20. De nadruk ligt hier, echter, is op de analyse van gepolariseerde membraan en lumen biogenese in één tubulaire cellen en de intracellulaire asymmetrie van endomembranes, cytoskeletal structuren en organellen die gepaard gaan met dit proces. De analyse wordt vergemakkelijkt door de eenvoud van deze buis, waar alle apicale membranen (op ultrastructureel niveau DN door microvilli) gezicht de lumen en alle basale membranen geconfronteerd met het oppervlak van de buitenste buis, met zijdelingse membranen contact met elkaar, van de apicale membraan gescheiden door kruispunten (Figuur 1 schematische; zie verwijzingen (^16,21) voor de C. elegans-specifieke organisatie van strakke en adherens junction componenten). Apicale membraan biogenese is dus samenvallen met lumen morfogenese. Bovendien, de grootte van volwassen intestinale cellen – de grootste cellen van dit kleine dier (met uitzondering van de uitscheidingsmechanisme cel) – onderlinge aanpassing van de grootte van een zoogdieren cel, waardoor het in vivo visuele volgen van subcellular elementen, bijvoorbeeld vesikel trajecten, die typisch geprobeerd in vitro in een cultuur schotel.

Met het oog op deze cellulaire en subcellular analyse is passende etikettering cruciaal. Intestinale endo – of plasma-membraan domeinen, kruispunten, cytoskeletalstructuren, kernen en andere subcellular organellen kunnen worden gevisualiseerd door het labelen van hun specifieke moleculaire componenten. Veel van dergelijke componenten hebben gekenmerkt en blijven om ontdekt te worden (tabel 1 geeft een paar voorbeelden en verwijst naar de middelen). Bijvoorbeeld, zijn verschillende moleculen de buizen en/of vesiculaire compartimenten van de intestinale endomembraansysteem, onderscheiden van het ER naar het Golgi via post-Golgi blaasjes aan het plasma-membraan, geïdentificeerde²². De specifieke eiwitten (evenals lipiden en suikers) kunnen ofwel gelabeld zijn direct of niet indirect via bindende eiwitten. Dit protocol is gericht op het in situ antilichaam kleuring van vaste specimens, één van de twee standaard labeling technieken (Zie het begeleidende document op uitscheidingsmechanisme kanaal tubulogenesis voor een beschrijving van de andere techniek² – in-vivo labeling via fluorescent proteïne fusies – die rechtstreeks toepasselijk zijn aan de darm; Tabel 2 bevat voorbeelden van darm-specifieke initiatiefnemers die kunnen worden gebruikt om de uitdrukking van deze fusie-eiwitten rijden naar de darm). Double- of meerdere labelen met beide benadering, of met een combinatie van beide plus extra chemische kleuring, kan meer diepgaande visuele resolutie en het onderzoek van de ruimtelijke en temporele veranderingen in co lokalisatie en aanwerving van specifieke moleculen of subcellular onderdelen (Figuur 2). De fixatie en kleuring van de in dit protocol steun behoud van groen fluorescent proteïne (GFP) labeling tijdens immunokleuring procedures beschreven procedures. Voor imaging, belangrijke punten van de detectie en karakterisatie van tubulogenesis fenotypen via microscopische standaardprocedures (fluorescentie ontleden en confocal microscopie) zijn beschreven ()Figuur 3, , 4). Deze kunnen worden uitgebreid tot hogere resolutie imaging benaderingen, voor aanleg super-resolution microscopie en Transmissie Electronenmicroscopie (hier niet beschreven).

Een sleutelsterkte van dit systeem is de mogelijkheid om het analyseren van polariteit in afzonderlijke cellen in verschillende ontwikkelingsstadia, van embryogenese via volwassenheid. Bijvoorbeeld, kan apicale domein en de lumen biogenese worden bijgehouden in de gehele ontwikkeling op het niveau van eencellige via labelen met ERM-1, een zeer geconserveerde membraan-actine linker van de Ezrin-Radixin-Moesin familie^23,24 . ERM-1 visualiseert apicale membraan biogenese (1) tijdens de embryonale buis morfogenese, wanneer deze gelijktijdig met gepolariseerde celdeling en migratie (cellen verplaatsen apically rond de lumen tijdens bekomt)^{15 optreedt}; (2) tijdens late embryonale en larvale buis uitbreiding dat de opbrengsten in de afwezigheid van celdeling of migratie; en (3) in de volwassen darm, waar de gepolariseerde membraan domeinen worden onderhouden (Figuur 1). In de groeiende post mitotische larvale epitheel, DOVO gepolariseerde membraan biogenese kan dus worden losgekoppeld van de gepolariseerde weefsel morfogenese, wat niet mogelijk is in de meeste modellen voor in vivo en in vitro epitheliale polariteit, met inbegrip van die met eencellige resolutie (bijvoorbeeld de 3D MDCK cyste model⁸). Met etikettering voor andere componenten, deze instelling biedt de mogelijkheid (met name bij de L1 larvale stadium wanneer de cellen hebben een hogere cytoplasma/nucleus ratio) te onderscheiden van de intracellulaire wijzigingen die specifiek zijn voor gepolariseerde membraan biogenese () bijvoorbeeld de heroriëntering van mensenhandel trajecten) van die gelijktijdig voor gepolariseerde celdeling en migratie.

De genetische veelzijdigheid van C. elegans is goed-bekende²⁵en maakt het een krachtig modelsysteem voor de moleculaire analyse van biologische vragen. Een studie over voedselproductie, bijvoorbeeld, kunt u beginnen met een wild-type stam, een transgene stam waar de structuur van belang (bijvoorbeeld een membraan) wordt aangeduid met een fluorescerende marker, of met een – of winst-van-verliesfunctie mutant met een defect in dit structuur. Een typische omgekeerde genetische studie kan het genereren van een mutant waar het gen van belang wordt verwijderd in de kiemcellen (bijvoorbeeld door een gerichte verwijdering), gewijzigd door mutagenese (meestal produceren puntmutaties met het daaruit voortvloeiende verlies, vermindering of winst in functie van het gen), of waar haar transcript door RNAi wordt verminderd. Het gemak van RNAi door voeding in C. elegans²⁶ leent zich ook voor het ontwerp van gerichte schermen die onderzoeken van een grotere groep van genen van belang. Een genetisch modelorganisme misschien wel grootste sterkte is het vermogen om uit te voeren in vivo voorwaartse schermen (bijvoorbeeld mutagenese, systematische of genoom-brede schermen van RNAi) waarmee een onbevooroordeeld onderzoek naar de moleculaire oorzaak voor een fenotype van belang. Bijvoorbeeld, een onbevooroordeelde visual C. elegans RNAi tubulogenesis scherm, dat begint met een transgene dieren met ERM-1-geëtiketteerden apicale membraan, ontdekt een intrigerende omkeerbare intestinale polariteit conversie en ectopische lumen fenotype, gebruikt hier als voorbeeld voor dit soort analyse. Dit scherm de uitputting van de glycosphingolipids (GSLs; obligate membraan lipiden, geïdentificeerd met behulp van hun GLS-biosynthetic enzymen) en onderdelen van het vesikel vacht clathrin en de AP-1 adapter geïdentificeerd als de specifieke moleculaire defecten veroorzaakt deze polariteit conversie fenotype, waardoor het karakteriseren van deze handel van moleculen als in vivo cues voor apicale membraan polariteit en positionering van^12,13lumen. Bij het starten met een specifieke genetische mutatie/morfogenese fenotype, kunnen dergelijke schermen (of één genetische/RNAi interactie experimenten) functionele interacties tussen twee of meerdere genen van belang (zie bijbehorende papier op het uitscheidingsmechanisme ook onderzoeken kanaal voor een voorbeeld van een dergelijke analyse)². Dit protocol is gericht op RNAi waarmee, naast de mogelijkheid om direct het identificeren van het gen waarvan verlies het fenotype in voorwaartse schermen veroorzaakt, specifieke voordelen worden ingesteld voor de analyse van de voedselproductie. Aangezien genproducten regisseren van voedselproductie vaak in een dosis-afhankelijke manier werken, is RNAi gewoonlijk succesvol in het genereren van een spectrum van fenotypen. De mogelijkheid voor het genereren van informatieve partiële-verlies-van-functie fenotypen helpt ook om het probleem dat de meerderheid van de genen van de belangrijke tubulogenesis van essentieel belang zijn en dat hun verliezen steriliteit en vroege embryonale letaliteit veroorzaken. Dit protocol omvat voorwaardelijke RNAi strategieën om deze moeilijkheid te overwinnen en stelt manieren voor het optimaliseren van het genereren van een breder spectrum van fenotypen, zoals een allèlique serie, geproduceerd door mutagenese.