Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Zelluläre Proteine können in zwei Klassen einteilen: diejenigen, die Membranen und diejenigen, die nicht zugeordnet sind. Nicht zugeordneten Membranproteine sind im Zytosol, Nukleoplasma und Lumina von Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (ER) gefunden. Es gibt zwei Klassen von Membran-assoziierte Proteine, integralen und peripheren. Integrale Membranproteine sind auch bekannt als transmembrane Proteine, weil ein oder mehrere Segmente der Polypeptid-Kette erstreckt sich über die Membran in der Regel als eine α-Helix bestehend aus hydrophoben Aminosäuren. Transmembrane Proteine sind co-translationally Membranen im Laufe des Jahres ihre Biosynthese eingeschoben und so konfigurierten bleiben, bis sie catabolized sind. Periphere Membranproteine sind sekundär, Membranen, meist als Folge von Post-translationale Modifikation mit hydrophoben Moleküle wie Lipide angetrieben. Im Gegensatz zur integralen Membranproteine die Vereinigung von peripheren Membranproteinen mit Zellmembranen ist reversibel und kann reguliert werden. Viele periphere Membran Proteine funktionieren im Signalwege und geregelte Zusammenarbeit mit Membranen ist ein Mechanismus zum Aktivieren oder hemmen einen Weg. Ein Beispiel für ein Signalmolekül, das eine periphere Membranprotein ist die kleine GTPase, RAS. Nach einer Reihe von post-translationalen Modifikationen, die Änderung mit einem Farnesyl-Lipid enthalten, fügt modifizierte C-Terminus eines ausgereiften RAS-Proteins in der zytoplasmatischen Broschüre von der Zellmembran. Insbesondere ist der Plasmamembran, wo die RAS die nachgeschaltete Effektor RAF1 eingreift. Um konstitutive Aktivierung von Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Weg zu verhindern, sind mehrere Ebenen von Kontrolle über RAS. Neben Rendern RAS durch hydrolysieren GTP in BIP inaktiv, können aktive RAS auch von der Plasmamembran durch Modifikationen oder Interaktionen mit Gefäss-Faktoren zur Signalisierung hemmen freigegeben werden. Obwohl fluoreszierende live Imaging Zellbiologen die Möglichkeit bietet, die subzelluläre Lokalisation der fluoreszierende Protein-Tags peripheren Membran Proteine¹beobachten, bleibt eine kritische Notwendigkeit auszuwertende Membran Verband der körpereigene Proteine semi-quantitativ mit einfachen biochemischen Ansätzen.

Die richtige biochemische Auswertung der Protein Aufteilung zwischen Membran und löslichen Brüche hängt entscheidend von zwei Faktoren ab: zelluläre Homogenisierung und effiziente Trennung von Membran und löslichen Brüche. Obwohl einige Protokolle, darunter die am weitesten verbreitete kommerzialisierten Kits von Waschmittel-basierte Zelle Homogenisierung abhängen, können diese Methoden Analyse durch die Gewinnung von Membranproteinen in die lösliche Phase²zu verschleiern. Dementsprechend liefern nicht Reinigungsmittel basierte, mechanische Methoden der Zellaufschluss sauberere Ergebnisse. Es gibt mehrere Methoden der mechanischen Störungen der Zellen in Kultur angebaut oder geerntet aus Blut oder Organe. Dazu gehören Dounce Homogenisierung, feinen Nadel Störung, kugelgelagerte Homogenisierung, Beschallung und Stickstoff Kavitation. Wir bewerten hier Stickstoff Kavitation und vergleichen es mit anderen Methoden. Stickstoff-Kavitation stützt sich auf Stickstoff, die in das Zytoplasma der Zellen unter hohem Druck aufgelöst wird. Nach Gleichgewichtherstellung wird die Zellsuspension abrupt auf den atmosphärischen Druck ausgesetzt, so dass Stickstoffluftblasen entstehen im Zytoplasma, die die Zelle als Folge ihrer Aufbrausen aufreißen. Wenn der Druck hoch genug ist, Stickstoff Aufbrausen stören kann der Kern³ und Membran gebunden Organellen wie Lysosomen⁴. Jedoch wenn der Druck gering genug gehalten wird, unterbrechen die Dekompression die Plasmamembran und ER aber nicht andere Organellen, dabei verschütten Zytosol und intakte zytoplasmatischen Organellen in der Homogenat, der die Cavitate⁵festgelegt ist. Aus diesem Grund ist Stickstoff Kavitation die Methode der Wahl für die Isolierung von Organellen wie Lysosomen und Mitochondrien.

Es ist jedoch auch eine hervorragende Möglichkeit der Vorbereitung eine homogenisierte, die leicht in Membran und löslichen Brüche unterteilt werden kann. Der Druckbehälter (“the Bomb” bezeichnet) verwendet, während Kavitation besteht aus einem dicken Edelstahl-Gehäuse, die hohen Druck mit einem Einlass für die Lieferung des Gases Stickstoff aus einem Tank und einem Auslass mit einem einstellbaren Auslassventil widersteht.

Stickstoff-Kavitation wurde für Zelle Homogenisierung seit den 1960er Jahren⁶verwendet. Im Jahr 1961 Jäger und Commerfold⁷ Stickstoff Kavitation als eine praktikable Option für Säugetier-Gewebe Störung etabliert. Seitdem Forscher haben die Technik, um verschiedene Zellen und Gewebe mit Erfolg angepasst, und Stickstoff Kavitation ist ein Grundnahrungsmittel in mehreren Anwendungen, einschließlich der Membran Vorbereitung^8,9, Kerne und Organelle geworden Vorbereitung^10,11, und labile biochemischen Abbau. Derzeit beschäftigen Zellbiologen häufiger andere Methoden der Zelle Homogenisierung, weil die Vorteile von Stickstoff Homogenisierung nicht weit ausgeschrieben, Stickstoff-Bomben teuer sind und es ist ein Irrglaube, das ist eine relativ große Anzahl von Zellen Erforderlich. Protokolle für Stickstoff Kavitation, zellfreie Homogenates mit intakten Zellkernen zu erreichen sind nicht veröffentlicht worden, und in die meisten veröffentlichten Bewertungen Volumen von 20 mL Zellsuspension dienten. Um diese klassische Technik aktuelle Anforderungen der Arbeit mit kleinen Proben entsprechend anzupassen, stellen wir einen geänderten Protokoll der Stickstoff Kavitation speziell für kultivierten Zellen. Nach Stickstoff Kavitation, das Homogenat ist getrennt in lösliche (S) und Membran (P) Brüche durch differentielle Zentrifugation, zuerst mit einem Lowspeed Spin, Kerne und ungebrochene Zellen zu entfernen, und dann mit einem High-Speed-Spin (> 100.000 x g) trennen Membranen aus der löslichen Fraktion. Wir analysieren die Effizienz der Trennung mit Immunoblots und Stickstoff Kavitation mit anderen Techniken, mechanische Störungen zu vergleichen. Wir untersuchen auch die osmotische Wirkung der Homogenisierung Puffer während Stickstoff Kavitation.