Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è quello di isolare le cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale. Alcune delle applicazioni includono l’utilizzo di queste cellule come biomarcatore per identificare i pazienti con rischio cardiovascolare, trattamento delle malattie ischemiche, e costrutti di creazione valvola vascolare e cuore tessutale.
Abstract
L’esistenza di cellule progenitrici endoteliali (EPC) nel sangue periferico e il suo coinvolgimento nella vasculogenesi fu riportata da Ashara e colleghi1. Più tardi, altri documentata l’esistenza di tipi simili di EPCs provenienti dal midollo osseo2,3. Più recentemente, Yoder e Ingram ha mostrato che EPCs derivate da sangue del cordone ombelicale aveva un potenziale proliferativo più elevato rispetto a quelli isolati da adulto periferico sangue4,5,6. Oltre ad essere coinvolti nella vasculogenesi postnatale, EPCs inoltre hanno indicato la promessa come una fonte di cellule per la creazione di ingegneria tissutale vascolare e cuore valvola costrutti7,8. Esistono diversi protocolli di isolamento, alcuni dei quali coinvolgono l’ordinamento delle cellule delle cellule mononucleari (MNCs) derivate dalle fonti indicate in precedenza con l’aiuto di markers endoteliali ed ematopoietiche, o coltura questi MNCs con crescita endoteliale specializzata medio, o una combinazione di queste tecniche9. Qui, presentiamo un protocollo per l’isolamento e coltura di EPCs utilizzando specializzati endoteliale supplementato con fattori di crescita, senza l’uso di immunosorting, seguita dalla caratterizzazione di cellule isolate mediante Western blotting e immunostaining.
Introduction
Parecchi ricercatori hanno studiato le caratteristiche e le potenzialità di umano EPCs5,10,11,12,13. EPC possono essere descritto come fare circolare le cellule che hanno la capacità di aderire al tessuto endoteliale nei siti di ipossia, ischemia, lesioni o di formazione del tumore e contribuiscono alla formazione di nuove strutture vascolari4,14. Loro coinvolgimento osservato nella neovascolarizzazione, sotto forma di vasculogenesi postnatale, ha condotto ad una comprensione della patofisiologia di queste cellule e il loro uso in applicazioni terapeutiche4,15, 16. il numero di EPCs in un individuo è stato indicato per essere correlati con patologia cardiovascolare9,15,16,17,18,19 ,20. Altri studi hanno anche differenziato EPCs in un fenotipo fibroblasto-come valvola e proposto che queste cellule potrebbero essere utilizzate per l’ingegneria dei tessuti cuore valvole7,21.
Le molecole di superficie determinata cella necessari per isolare EPCs non sono stati chiaramente identificate a causa di discrepanze tra le indagini4. L’adesione delle MNCs per una certa matrice, con l’esposizione a una varietà di condizioni di coltura, è stata eseguita da diversi gruppi1,17,22,23, suggerendo che presunto EPCs può visualizzare le proprietà fenotipiche differenti. Queste proprietà includono la mancanza di abilità phagocytotic, la formazione del tubo in Matrigel e l’assorbimento delle lipoproteine a bassa densità di Dil-acetilato. L’alta clonogenic e potenziale proliferativo sono due proprietà con cui EPCs può essere gerarchizzato5. EPCs possono anche formare in vitro i tubuli quando cocultured con fibroblasti di polmone fetale umano4. Queste cellule sono conosciute per esprimere gli indicatori di superficie delle cellule endoteliali e di condividere alcuni dei marcatori ematopoietici13,24,25. I marcatori espressi positivamente che sono ampiamente accettati per la fenotipizzazione EPCs sono CD31, CD34, fattore di crescita endoteliale vascolare receptor 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (vWF), CD133, c-Kit e vascolare endoteliale caderina (VE-caderina)4 , 18. non sono considerate essere EPCs a causa della loro limitata capacità proliferativa potenziali, di fagocitare batteri e incapacità di formare de novo umano cellule che co-esprimono CD90, CD45, CD14, CD115 o l’actina alfa-liscia del muscolo (α-SMA) vasi in vivo4,7. Questo articolo descrive un protocollo modificato per l’isolamento di cellule progenitrici endoteliali dal sangue del cordone ombelicale umano senza la necessità di qualsiasi cella ordinamento protocolli. In questo articolo abbiamo usato CD31, CD34 e VEGFR2 come gli indicatori positivi, con α-SMA come indicatore negativo.
In questo articolo, vi proponiamo un metodo di isolamento e coltura delle cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale senza cella ordinamento utilizzando specializzato supplementato crescita endoteliale con fattori di crescita (EGM). Questo EGM contiene fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e fattore di crescita del fibroblasto (FGF), che migliorano la sopravvivenza, la proliferazione e la migrazione di cellule endoteliali26. Include anche l’acido ascorbico, che è responsabile del mantenimento della morfologia di ciottoli delle cellule; 1 fattore di crescita insulino-simile (IGF-1), che fornisce angiogenici e funzione migratori; e l’eparina, che provoca una migliore stabilità a lungo termine dei fattori di crescita nel medio26. Altri fattori di crescita aggiunti al terreno di coltura delle cellule endoteliali comprende il completamento con fattore di crescita epidermico (EGF), che aiuta a stimolare la proliferazione delle cellule e differenziazione e idrocortisone, che sensibilizza le cellule per EGF26 . Indichiamo che l’utilizzo di questo mezzo di crescita specifici rendimenti più alti numeri di EPCs rispetto al medio basale endoteliale (EBM) o per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco).
Protocol
Representative Results
Discussion
Come accennato in precedenza, aderente EPCs possiedono una morfologia di ciottoli. Nostro MNCs isolato progredito da una colonia di cellule fusiformi (Figura 2A-2D) nelle prime fasi di una colonia di ciottoli (Figura 2E-2F) per un periodo di dieci giorni nella cultura. EPC sono state etichettate in modo diverso dai gruppi di ricerca differenti, vale a dire come ritardati di cellule progenitrici endoteliali10</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation Grant No. CMMI-1452943 e dall’Università di Honors di Università dell’Arkansas. Vorremmo anche riconoscere l’Arkansas Cord Blood Bank per averci fornito unità cordonali.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
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