Modellazione dell'amiloide-β42 tossicità e neurodegenerazione nel cervello adulto di Zebrafish
Summary
Questo protocollo descrive la sintesi, la caratterizzazione e l’iniezione dei peptidi monomerici amiloide-β42 per la generazione di tossicità dell’amiloide in zebrafish adulto per stabilire un modello di malattia di Alzheimer, seguito da analisi istologiche e rilevazione di aggregazioni.
Abstract
Morbo di Alzheimer (annuncio) è una malattia neurodegenerative in cui accumulo di amiloide tossico-β42 (Aβ42) peptidi conduce a degenerazione sinaptica, infiammazione, morte di un neurone debilitante e deficit dell’apprendimento. Gli esseri umani non possono rigenerare i neuroni persi nel caso di annuncio in parte a causa di alterata capacità proliferativa delle cellule staminali/progenitrici neurali (NSPCs) e ridotta neurogenesi. Di conseguenza, terapie rigenerative efficiente dovrebbero anche migliorare la proliferazione e neurogena capacità di NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) è un organismo rigenerativo, e possiamo imparare i programmi base molecolari con cui potremmo progettare approcci terapeutici per affrontare AD. Per questo motivo, la generazione di un modello di annuncio-come in zebrafish era necessaria. Utilizzando la nostra metodologia, possiamo introdurre derivati sintetici di Aβ42 peptide con capacità penetrante di tessuto nel cervello adulto zebrafish e analizzare la patologia della malattia e della risposta rigenerativa. Il vantaggio sopra i metodi esistenti o modelli animali è che zebrafish può insegnarci come un cervello dei vertebrati può rigenerare naturalmente e quindi ci aiutano a curare le malattie neurodegenerative umana meglio prendendo di mira NSPCs endogeno. Pertanto, il modello di tossicità dell’amiloide stabilito nel cervello adulto zebrafish può aprire nuove strade per la ricerca nel campo delle neuroscienze e della medicina clinica. Inoltre, la semplice esecuzione di questo metodo consente conveniente ed efficiente valutazione sperimentale. Questo manoscritto descrive la sintesi e l’iniezione di Aβ42 peptidi nel cervello di zebrafish.
Introduction
Annuncio è una malattia cronica progressiva caratterizzata dalla perdita di neuroni e sinapsi in corteccia cerebrale1,2,3,4,5. I marchi di garanzia neuropathological classiche dell’annuncio sono la deposizione dei peptidi amiloidi e formazione del neurofibrillary tangles (NFTs)6. Le placche senili, noto anche come placche amiloidi, sono composti da peptidi dell’amiloide-β (Aβ) che formano strutture β-pieghettato in parenchima del cervello5. L’accumulo di Aβ42 nei pazienti dell’annuncio ha un ruolo critico e primo in progressione di malattia. Annuncio innesca una cascata di eventi che conducono alla disfunzione sinaptica, plasticità alterata e perdita di un neurone7,8,9,10.
Il cervello adulto di teleostei zebrafish serve come un eccellente modello per studiare la regolazione della plasticità delle cellule staminali11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 e varie malattie nel sistema nervoso centrale (CNS), tra cui annuncio21,22,23 ,24. A causa di una vasta gamma di metodi sperimentali disponibili19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, questi studi sono informativi e fattibile. Zebrafish può ricostituire il CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, in parte utilizzando programmi molecolari attivati dopo la perdita di un neurone19,39,40,41,42,43, 44. Quindi, che stabilisce un modello di malattia neurodegenerative in zebrafish può aiutare a affrontare le questioni romanzo per quanto riguarda biologia rigenerativa di capacità e di cellule staminali nel cervello dei vertebrati.
Recentemente, abbiamo sviluppato un modello di tossicità dell’amiloide nel cervello adulto zebrafish iniettando sintetico Aβ42 peptidi (tabella 1)39. Questa iniezione causato neurodegenerazione fenotipi ricordano la patologia del cervello umano (ad esempio, la morte delle cellule, l’attivazione microgliale, degenerazione sinaptica e i deficit di memoria), che indica che zebrafish può essere utilizzato per suscitare neurodegenerazione nel cervello di zebrafish, Aβ42 peptidi possono essere rilevati con gli stainings di immunohistochemical e meccanismi molecolari della rigenerazione in zebrafish adulto che CNS può essere identificato39. In questo protocollo, dimostriamo l’iniezione di peptidi sintetici dell’amiloide nel cervello zebrafish utilizzando un intracerebroventricolare iniezione (CVMI) metodo27,39,45,46 per imitare il deposito dell’amiloide (Figura 1). CVMI fornisce un nuovo modo di erogare i peptidi, che aggregano all’iniezione come β-foglio strutture ed esercitano tossicità. I peptidi sono distribuiti uniformemente in tutto il cervello, come target l’area ventricolare lungo l’intero asse rostro-caudale45. Inoltre, questo metodo consente per analizzare la risposta morfologica e molecolare di NSPCs nel cervello adulto zebrafish dopo inclusioni dell’amiloide. Tali studi ci fornirà un’idea per la riparazione del danno cerebrale successo nei mammiferi. Il nostro metodo può essere utilizzato per capire il meccanismo molecolare necessario di una risposta di successo di rigenerazione dopo annuncio-come i sintomi per indurre la rigenerazione dei neuroni persi e recupero funzionale.
Protocol
Representative Results
Discussion
I peptidi dell’amiloide possono essere modificati per includere le variazioni di sequenza o vari tag. Per esempio, può essere generato un peptide amiloide uova strapazzato, e i peptidi possono essere etichettati con tag fluorescente al N-terminale dell’estremità del peptide o etichettati come vettore peptidi39. Allo stesso modo, in questo protocollo, il peptide vettore è il cellula-penetrante peptide TR a causa della sua efficacia a carico di trasporto profondo nel tessuto di cervello<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da DZNE e l’Associazione Helmholtz (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) e DFG (KI1524/6) (C.K.); e dall’associazione di Leibniz (SAW-2011-IPF-2) e BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vorremmo anche ringraziare Ulrike Hofmann per sintesi peptidica e Nandini Asokan, Prayag Murawala e Elly Tanaka per aiuto durante le riprese la procedura.
Materials
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
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