在这里,我们提出了应用于拟南芥叶肉叶肉原生质体的相互作用捕获方案。该方法严格依赖于体内紫外线交联,并允许从生理环境中分离和鉴定植物mRNA结合蛋白。
RNA结合蛋白(RBP)决定RNA的命运。他们参与所有的RNA生物发生途径,特别有助于信使RNA(mRNA)的转录后基因调控(PTGR)。在过去几年中,已经通过使用称为“mRNA相互作用捕获”的新方法成功地分离了许多来自酵母和哺乳动物细胞系的mRNA结合蛋白质组,其允许鉴定mRNA结合蛋白(mRBP)直接从生理环境。该方法由体内紫外(UV)交联,寡核苷酸(dT)珠的信使核糖核蛋白复合物(mRNP)的下拉和纯化以及随后通过质谱(MS)鉴定交联蛋白质组成。最近,通过应用相同的方法,已经从不同的拟南芥组织来源同时报道了几种植物mRNA结合的蛋白质组:病毒幼苗,叶组织,叶肉叶原生质体和培养根细胞。在这里,我们提出了拟南芥叶肉叶片原生质体的优化的mRNA相互作用捕获方法,这是一种细胞类型,其用作包括各种细胞测定的实验的通用工具。最佳蛋白质产量的条件包括起始组织的量和UV照射的持续时间。在从中等规模实验(10 7个细胞)获得的mRNA结合蛋白质组中,发现具有RNA结合能力的RBP被超表达,并且鉴定出许多新的RBP。实验可以放大(10 9个细胞),优化的方法可以应用于其他植物细胞类型和物种,以广泛分离,编目和比较植物中mRNA结合的蛋白质组。
真核生物使用多个RNA生物发生调控途径来维持细胞生物学过程。在已知类型的RNA,mRNA的是非常多样的并携带的蛋白质的编码能力和它们的同种型1个 .The PTGR通路引导预的mRNA 2,3的命运。来自不同基因家族的RBPs控制RNA的调节,并且在PTGR中,特异性mRBP通过直接物理相互作用指导mRNAs,形成功能性mRNP。因此,识别和表征mRBPs及其mRNP对于了解细胞mRNA代谢的调节至关重要2。在过去三十年中,各种体外方法 – 包括RNA电泳迁移率转移(REMSA)测定法,通过指数富集测定系统进化配体(SELEX),基于文库衍生构建体,RNA Bind-n-Seq(RBNS),放射性标记或定量荧光RNA结合测定法,X-射线晶体学和NMR光谱法4,5,6,7,8,9 -已被广泛应用到限制性商业惯例的研究,主要是从哺乳动物细胞。这些哺乳动物RBP研究的结果可以通过RNA结合蛋白DataBase(RBPDB)进行搜索,收集了已发表的观察10 。
尽管这些体外方法是强大的工具,但它们确定了来自给定的RNA序列库的结合RNA基序,因此在发现新的靶RNA的能力方面受到限制。计算策略预测基因组范围的RBP也是如此,它们基于蛋白质序列和结构15的保守性。为了克服这个,一个新的实验方法哈已被确定,其允许识别感兴趣的RBP相互作用的RNA图案,以及用于确定结合的精确位置。这种称为“交联和免疫沉淀”(CLIP)的方法由体内紫外线交联,然后进行免疫沉淀11 。早期研究表明,DNA和RNA核苷酸的光激活可以发生在大于245nm的激发UV波长处。通过胸苷的反应似乎是有利的(按光反应性降低的顺序排列:dT≥dC> rU> rC,dA,dG) 12 。使用波长为254nm(UV-C)的紫外光,观察到当RNA核苷酸和蛋白质残基之间的共价键仅在几埃(Å)的范围内时产生。因此,这种现象称为RNA和RBP的“零长度”交联。之后可以进行严格的净化程序很少背景13,14杜热。
与CLIP相辅相成的策略是将体内紫外线交联与蛋白质鉴定相结合,以描述RBP的景观。许多这样的全基因组基因结合的蛋白质组已经从酵母细胞,胚胎干细胞(ESC),并使用该新的实验方法的人细胞系( 即,HEK293和HeLa)中分离,被称为“mRNA的相互作用组捕获” 18 19,20,21。该方法由体内紫外线交联,然后是mRNP纯化和基于MS的蛋白质组学。通过应用这种策略,已经发现了许多含有非典型RBD的新型“月光”RBP,并且已经清楚的是,更多的蛋白质具有比以前所想象的RNA结合能力“> 15,16,17,使用这种方法允许新的应用程序和调查限制性商业惯例时,回答新的生物学问题的能力。例如,最近的一项研究调查了mRNA的结合蛋白质(核心RBP的保护蛋白质组)酵母和人类细胞之间22 。
已经发现植物限制性商业惯例参与生长和发育( 例如 ,在开花时间的转录后调节,昼夜节律钟,并在线粒体和叶绿体基因表达)的24,25,26,27,28,29 。此外,他们被认为在响应非生物胁迫的细胞过程中进行功能( 例如,感冒,干旱,salinity,和脱落酸(ABA))31,32,33,34。基于RNA识别基序(RRM)和K同源性(KH)结构域序列基因, 拟南芥基因组中有超过200种预测的RBP基因;在水稻,大约250已注意到35,36。值得注意的是,许多预测限制性商业惯例似乎是独特的植物( 例如,没有后生动物直向同源物,以含有RRM结构域预测拟南芥限制性商业惯例的约50%)35,这表明许多可以用作新的功能。大多数预测RBP的功能仍然没有表征23 。
通过使用来自拟南芥的幼苗,叶组织,培养的根细胞和叶肉叶原生质体的mRNA结合的蛋白质组分离基因相互作用组捕获近日有报道称38,39。这些研究表明在不久的将来系统地对植物功能性RBP进行编目的潜力很大。在这里,我们提出了从植物原生质体( 即没有细胞壁的细胞)捕获mRNA相互作用的方案。 拟南芥叶片叶肉原生质体是叶细胞的主要类型。分离的原生质体允许UV光最佳地接近细胞。这种细胞类型可以在瞬时表达功能表征40,41蛋白质测定中。此外,原生质体已被应用到其它几种植物细胞类型和物种42,43,44( 例如,彼得森等人 ,2009;和巴格曼伯恩鲍姆,2010;和Hong 等人 ,2012)。
<p class ="“jove_content”">该方法总共包含11个步骤( 图1A )。首先分离拟南芥叶肉叶肉原生质体(步骤1),随后UV照射形成交联的mRNP(步骤2)。当原生质体在变性条件下裂解(步骤3)时,将交联的mRNP释放在裂解/结合缓冲液中,并通过oligo-d(T) 25珠(步骤4)下拉。经过几轮严格洗涤后,将mRNPs纯化并进一步分析。在纯化交联的mRNA之前,通过蛋白酶K消化mRBPs的变性肽,并通过qRT-PCR验证RNA质量(步骤5和6)。经RNA酶处理和蛋白质浓缩(步骤7)后,蛋白质质量由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和银染法(步骤8)进行控制。在交联样品(CL)和非交联样品(非CL;交联样品)之间,蛋白质带图案的差异可以容易地可视化。来自不经受紫外线照射的原生质体的阴性对照样品)。蛋白质的鉴定通过基于MS的蛋白质组学获得。通过一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D-PAGE)分离来自CL样品的蛋白质以除去可能的背景污染,并使用胰蛋白酶将其“凝胶内消化”成短肽,并进行纯化(步骤9)。偶联到质谱(纳米LC-MS)的纳米反相液相色谱法允许测定mRNA结合蛋白质组中的确定蛋白质的量(步骤10)。最后,使用生物信息学分析对所鉴定的mRBP进行表征和编目(步骤11)。我们成功应用开发用于酵母和人类细胞的mRNA相互作用捕获,植物叶肉叶原生质体。叶肉叶细胞是植物叶片中主要类型的地面组织。该方法的主要优点是其使用体内交联从生理环境中发现蛋白质。
在这个协议中,我们主要存在许多的优化实验条件50( 例如,原生质体的数量以作为起始原料和UV辐射的持续时间使用)。当使用至少10 7个原?…
The authors have nothing to disclose.
我们承认Joris Winderickx教授的实验室,该实验室提供配有常规紫外灯的紫外线交联设备。 KG由KU Leuven研究基金支持,并承认FWO授予G065713N的支持。
REAGENTS | |||
0.8 M Mannitol | Sigma | M1902-500G | Primary isotonic Enzyme solution & MMg solution |
2M KCl | MERCK | Art. 4935 | Primary isotonic Enzyme solution & W5 buffer |
0.2 M MES (pH 5.7) (4-morpholineethanesulfonic acid) |
Sigma-aldrich | M2933 | Primary isotonic Enzyme solution, W5 buffer & MMg solution, Filtration sterilization |
Cellulase R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | CELLULASE “ONOZUKA” R-10, 10 g |
Final isotonic enzyme solution |
Macerozyme R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | MACEROZYME R-10, 10g | Final isotonic enzyme solution |
10% (w/v) BSA (Bovine Serum Albumin) |
Sigma-aldrich | A7906-100G | Final isotonic enzyme solution & Filtration sterilization |
1M CaCl2 | Chem-Lab NV | CL00.0317.1000 | Final isotonic enzyme solution, W5 buffer & Digestion buffer |
1M NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | W5 buffer |
2M MgCl2 | Sigma | M8266-100G | MMg solution |
1M LiCl (Lithium Chloride) |
Acros | 199885000 | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2 & Low salt buffer |
5% (w/v) LiDS (Lithium Dodecyl Sulphate) |
Sigma-aldrich | L4632-25G | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1 & Filtration sterilization |
1M DTT (Dithiothreitol) |
Thermo Fisher Scientific Wash buffer 1 & Wash buffer 2 |
307866 | Lysis/binding buffer, |
1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) | Acros & Fisher Chemical |
167620010 & H/1200/PB15 |
Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer & Elution buffer |
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-aldrich | ED-500G | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer & Elution buffer |
Tween 20 | MERCK | 8.22184.0500 | Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
0.1 M NaOH | VWR PROLABO CHEMICALS | 28244.295 | Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
1X PBS (pH 7.4) (Phosphate Buffered Saline) containing (NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4) |
Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC |
S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230 |
Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
Proteinase K solution (2 μg/μL) | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Protein digestion |
Loading dye | Invitrogen | LC5925 | SDS-PAGE |
qPCR master mix | Promega | A6001 | qRT-PCR assay |
RNase Cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | RNA digestion |
Methanol | Sigma-aldrich | 322415 | Gel fixation and gel destaining |
Acetic acid | Sigma-aldrich | 537020 | Gel fixation and gel destaining |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Fisher Scientific | 20278 | Gel staining |
1M NH4HCO3 (Ammonium bicarbonate) |
Sigma-aldrich | 09830-500G | Gel hydration & Digestion buffer |
CH3CN (Acetonitrile) |
Sigma-aldrich | 34851-100ML | Gel dehydration & Peptide dissolving solution |
IAA (Iodoacetic acid) |
Sigma-aldrich | I4386-10G | Alkylating agent |
TFA (Trifluoroacetic acid) |
Sigma-aldrich | 302031-10X1ML | Peptide dissolving solution |
FA (Formic acid) |
Sigma-aldrich | 06554-5G | Peptide extraction |
Trypsin solution (6 ng/μL) | Promega | V5280 | Digestion buffer |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT | |||
Soil | Peltracom | LP2D | Plant growth |
Vermiculite 3 | Sibli AS | 05VERMICULIET | Plant growth |
Petri dish (150 x 20 mm) | Sarstedt | 82.1184.500 | Carrier for protoplast suspension |
0.22 μm filter | Millipore | SE2M229104 | Homogenization of final isotonic enzyme solution |
Razorblade | Agar Scientific | T585 | Rosette leaf strips |
35-75 μm nylon mesh | SEFAR NITEX | 74010 | Protoplast suspension filtration |
50 mL round bottom tubes | Sigma-aldrich | T1918-10EA | Carrier for protoplast suspension |
Hemocytometer (Bürker hemocytometer) |
MARIENFELD | 650030 | Protoplast cell counting |
UV crosslinking apparatus (HL-2000 HybriLinker) |
UVP, LLC | UVP95003101 | in vivo UV crosslinking |
UV lamp (Sankyo-Denki G8T5) |
SANKYO DENKI |
SD G8T5 | in vivo UV crosslinking |
50 mL glass syringe | FORTUNA Optima | Z314560 | Homogenization of protoplast lysate |
Narrow needle (0.9 x 25 mm) | Becton Dickinson microlance 3 | 2021-04 | Homogenization of protoplast lysate |
Rotator Model L26 | Labinco BV | 26110912 | Sample incubation by rotating |
Oligo-d(T)25 magnetic beads (5 mg/mL) |
New England BioLabs | S1419S | mRNPs and mRNAs binding and pull-down |
Magnetic rack | Invitrogen | CS15000 | mRNPs and mRNAs binding and pull-down |
Centrifugal filter units (Amicon Ultra-4 centrifugal filter units) |
EMD Millipore | UFC800308 | mRBP concentration |
Pierce Silver Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | 24612 | Silver-staining assay |
RNA purification kit (InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit) |
STRATEC Molecular | 1064100300 | RNA purification |
Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | RNA quality and quantity |
Real-Time PCR cycler (StepOne Real-Time PCR cycler) |
Thermo Fisher Scientific | 4376600 | cDNA quantification |
µ-C18 columns (Millipore Zip Tip µ-C18 columns) |
Sigma-aldrich | 720046-960EA | Peptide purification |
Mass spectrometer (Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer) |
Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Mass spectrometry-based proteomics |
Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | Mass spectrometry-based proteomics |
C18 column (Easy Spray Pepmap RSLC C18 column) |
Thermo Fisher Scientific | ES800 | Mass spectrometry-based proteomics |
C18 precolumn (Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn) |
Thermo Fisher Scientific | 160321 | Mass spectrometry-based proteomics |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers for qRT-PCR assay | Sequences | ||
UBQ10 mRNA (Li et al., 2014) |
Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA |
||
18S rRNA (Durut et al., 2014) |
Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA |