Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Os eucariotas usam múltiplos caminhos regulatórios da biogênese do ARN para manter os processos biológicos celulares. Entre os tipos conhecidos de ARN, o ARNm é muito diverso e traz a capacidade de codificação das proteínas e suas isoformas ^1. A via PTGR direciona o destino dos pré-mRNAs ^{2 , 3} . RBPs de diferentes famílias de genes controlam a regulação do RNA, e em PTGR, mRBPs específicos orientam os mRNAs através de interações físicas diretas, formando mRNPs funcionais. Portanto, identificar e caracterizar mRBPs e seus mRNPs é fundamental para a compreensão da regulação do metabolismo do mRNA celular ^2. Nas últimas três décadas, vários métodos in vitro – incluindo ensaios de mudança de mobilidade eletroforética de RNA (REMSA), evolução sistemática de ligandos por ensaios exponenciais de enriquecimento (SELEX) com base em construções derivadas da biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcados ou quantitativosEnsaios de ligação de ARN de fluorescência, cristalografia de raios X e espectroscopia de RMN ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} – foram amplamente aplicados a estudos de RBPs, principalmente de células de mamífero. Os resultados desses estudos de RBPs de mamíferos podem ser pesquisados ​​através da Base de Proteínas de Proteção de RNA (RBPDB), que coleta as observações publicadas ¹⁰ .

Embora essas abordagens in vitro sejam ferramentas poderosas, elas determinam os motivos de RNA vinculados a partir de um conjunto de sequências de RNA dado e, portanto, são limitadas na capacidade de descobrir novos RNAs alvo. O mesmo é verdade para estratégias computacionais para prever RBPs em todo o genoma, que se baseiam na conservação da seqüência e estrutura da proteína ¹⁵ . Para superar isso, um novo método experimental haFoi estabelecido que permite a identificação dos motivos RNA de que um RBP de interesse interage, bem como para a determinação da localização precisa da ligação. Este método, denominado "reticulação e imunoprecipitação" (CLIP), é composto de reticulação UV in vivo seguida de imunoprecipitação ¹¹ . Estudos iniciais mostraram que a fotoativação de nucleotídeos de DNA e RNA pode ocorrer em comprimentos de onda ultravioleta de excitação superiores a 245 nm. A reacção através da timidina parece ser favorecida (classificação por ordem de redução da fotoreactividade: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) ¹² . Usando luz UV com um comprimento de onda de 254 nm (UV-C), observou-se que as ligações covalentes entre os nucleotídeos de ARN e os resíduos de proteínas são criados quando na faixa de apenas alguns Angstroms (Å). O fenômeno é, portanto, chamado de reticulação "zero-length" de RNA e RBP. Isto pode ser seguido por um rigoroso processo de purificação Com poucos antecedentes ^{13 , 14} .

Uma estratégia complementar ao CLIP é combinar reticulação UV in vivo com identificação de proteína para descrever a paisagem de RBPs. Vários desses proteomas ligados a ARNm do genoma foram isolados a partir de células de levedura, células-tronco embrionárias (ESC) e linhas celulares humanas ( ou seja, HEK293 e HeLa) utilizando esta nova abordagem experimental, chamada "captura de intercepto de mRNA" ^{18 , 19 , 20 , 21} . O método é composto de reticulação ultravioleta in vivo seguido por purificação de mRNP e proteômica baseada em MS. Ao aplicar esta estratégia, descobriram-se muitas RBPs "nítidas" que contêm RBDs não-canônicas, e tornou-se claro que mais proteínas possuem capacidades de ligação ao ARN do que se supunha anteriormente"> 15 ^{, 16 , 17.} O uso deste método permite novas aplicações e a capacidade de responder a novas questões biológicas ao investigar RBPs. Por exemplo, um estudo recente investigou a conservação do proteoma vinculado ao mRNA (RBP do núcleo) Proteoma) entre leveduras e células humanas ²² .

Os RBPs da planta já foram encontrados envolvidos no crescimento e no desenvolvimento ( por exemplo , na regulação pós-transcrição do tempo de floração, no relógio circadiano e na expressão gênica nas mitocôndrias e cloroplastos) ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29} . Além disso, eles são pensados ​​para desempenhar funções nos processos celulares que respondem a estresses abióticos ( por exemplo, frio, seca, saLinidade e ácido abscísico (ABA)) ^{31 , 32 , 33 , 34} . Existem mais de 200 genes de RBP previstos no genoma de Arabidopsis thaliana , com base em motivos de reconhecimento de RNA (RRM) e homologia de K (KH); Em arroz, aproximadamente 250 foram observados ^{35 , 36} . É notável que muitas RBPs preditas parecem ser únicas para as plantas ( por exemplo, nenhum orthologs metazoários para aproximadamente 50% das RBPs Arabidopsis previstas contendo um domínio RRM) ³⁵ , sugerindo que muitos podem servir novas funções. As funções das RBPs mais preditas permanecem não caracterizadas ²³ .

O isolamento de proteomas ligados a mRNA de mudas etioladas de Arabidopsis , tecido foliar, células radiculares cultivadas e protoplastos de mesofila foliar através do uso deA captura de intercepto de mRNA foi recentemente relatada ^{38 , 39} . Esses estudos demonstram o forte potencial de catalogação sistemática de RBPs funcionais em plantas em um futuro próximo. Aqui, apresentamos um protocolo para captura de intereleto de mRNA a partir de protoplastos de plantas ( isto é, células sem paredes celulares). Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana são o principal tipo de célula foliar. Os protoplastos isolados permitem o acesso ideal da luz UV às células. Este tipo de célula pode ser usado em ensaios que expressam transitoriamente proteínas para caracterização funcional ^{40 , 41} . Além disso, o protoplasting foi aplicado a vários outros tipos de células vegetais e espécies ^{42 , 43 , 44} ( eg, Petersson et al ., 2009; Bargmann e Birnbaum, 2010; e Hong et al ., 2012).

<P class = "jove_content"> O método abrange um total de 11 passos ( Figura 1A ). Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis são primeiro isolados (passo 1) e subsequentemente são irradiados com UV para formar mRNPs reticulados (passo 2). Quando os protoplastos são lisados ​​em condições de desnaturação (passo 3), as mRNP reticuladas são liberadas em tampão de lise / ligação e puxadas pelas pérolas oligo-d (T) ₂₅ (passo 4). Após várias rodadas de lavagens rigorosas, os mRNPs são purificados e analisados ​​posteriormente. Os péptidos desnaturados de mRBPs são digeridos pela proteinase K antes dos mRNAs reticulados serem purificados e a qualidade do RNA é verificada por qRT-PCR (passos 5 e 6). Após o tratamento com RNase e a concentração de proteína (passo 7), a qualidade da proteína é controlada por electroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) e coloração com prata (passo 8). A diferença nos padrões de banda proteica pode ser facilmente visualizada entre uma amostra reticulada (CL) e uma amostra não reticulada (não CL;A amostra de controle negativo de protoplastos que não está sujeita a irradiação UV). A identificação de proteínas é conseguida através de proteômica baseada em MS. As proteínas da amostra de CL são separadas por electroforese em gel de poliacrilamida unidimensional (1D-PAGE) para remover a possível contaminação de fundo, são "digeridas em gel" em péptidos curtos usando tripsina e são purificadas (passo 9). A cromatografia líquida nano de fase inversa acoplada à espectrometria de massa (nano-LC-MS) permite a determinação da quantidade de proteínas definitivas no proteoma ligado ao mRNA (passo 10). Finalmente, os mRBP identificados são caracterizados e catalogados usando a análise bioinformática (etapa 11).