Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien
Summary
Quantifizierung der Spender gewonnenen Zellen ist erforderlich, um Engraftment nach Stammzelltransplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien überwachen. Eine Kombination von Flow Cytometry-basierte Zellsortierung Kolonie Bildung Assay und anschließende Analyse von kurzen Tandem, die wiederholt verwendet werden, um die Verbreitung zu beurteilen und Differenzierung im Fach erythroiden Vorläuferzellen.
Abstract
Das Vorhandensein von unvollständigen Chimerism ist in einem Großteil der Patienten nach Knochenmarktransplantation für große Thalassämie oder Sichelzellenanämie vermerkt. Diese Beobachtung hat enorme Auswirkungen, da spätere therapeutische Immunmodulation Strategien klinische Outcome verbessern können. Konventionell, dient Polymerase Kettenreaktion-basierte Analyse der kurze Tandemwiederholungen Chimärismus in Spender stammenden Blutkörperchen zu identifizieren. Allerdings ist diese Methode beschränkt sich auf kernhaltigen Zellen und kann nicht unterscheiden zwischen dissoziierten einzellige Abstammungen. Wir die Analyse der kurze Tandemwiederholungen durchflusszytometrischen sortiert hämatopoetischen Vorläuferzellen zu fließen und verglichen mit der Analyse der kurze Tandemwiederholungen aus ausgewählten Burst-bildende Einheit – erythroiden Kolonien gewonnen, beide aus dem Knochen gesammelt Knochenmark. Mit dieser Methode können wir die verschiedenen Proliferation und Differenzierung der Spenderzellen in erythroiden Fach unter Beweis stellen. Diese Technik ist berechtigt, Stromüberwachung von Chimärismus in der Stammzell-Transplantation Einstellung abzuschließen und somit möglicherweise angewandte künftig klinische Studien, Stammzellforschung und Gestaltung der Gen-Therapie-Studien.
Introduction
Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist der einzige verfügbare kurative Ansatz für eine Vielzahl von angeborenen genetischen Erkrankungen des blutbildenden Systems, krankheitsfreien Überlebensraten von über 90 % zu erreichen, denn sonst stark beeinträchtigt und lebensdauerbegrenzten Patienten1. Die Wirksamkeit dieses wichtige therapeutische Werkzeug optimiert durch die Begrenzung der Toxizität von Pre- und nach der Transplantation Therapien2, aber auch durch Interventionen auf die Aufrechterhaltung stabiler Organfunktion, quantifiziert die durch genaue Beobachtung der Spender-abgeleitete Zellen3,4,5.
Im Allgemeinen bedeutet vollständige Chimärismus (CC) Totalersatz des Fachs Lymphohematopoietic von Spender-abgeleitete Zellen, während der Begriff gemischten Chimärismus (MC) verwendet wird, wenn Spender und Empfänger-abgeleitete Zellen gleichzeitig in verschiedenen vorhanden sind Proportionen. Split-Chimärismus (SC) bezeichnet das Zusammenleben von gemischten Chimärismus in einzellige Linien, wie z. B. in der erythroiden Fach beobachtet. Schnelle Bestimmung der Chimerism Status nach HSCT ist kritisch, da es dazu beitragen kann, anfällig für Krankheiten Rückfall und initiieren nachfolgende immunmodulatorische Strategien, wie Spender-Lymphozyten Infusionen oder Reduktion der immunsuppressiven Patienten identifizieren Therapien-6.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt für die Überwachung der Engraftment nach HSCT. Isotyping von Immunglobulinen und Analyse der Zytogenetik haben schlechte Empfindlichkeit und sind in ihrer Fähigkeit zu erkennen, Polymorphismus7,8begrenzt. Die Einführung der Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Empfindlichkeit in Chimerism Überwachung nach HSCT verbessern kann, sondern beschränkt sich auf Sex nicht übereinstimmende Allografts9. Derzeit, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist die am weitesten verbreitete Methode zur Chimerism eingesetzt und basiert auf herkömmlichen Agarose-Acrylamid Gelelektrophorese der Variable Zahl Tandemwiederholungen (VNTRs) oder kurze Tandem wiederholt (STRs). Routinemäßig verwendet ist quantitative PCR einen extrem kleinen Teil der verbleibenden Spenderzellen nach HSCT zu erkennen. Die größte Beschränkung der Studien so weit ist, dass MC-Erkennung beschränkt sich fast ausschließlich auf das Vorhandensein von kernhaltigen Zellen, anstatt Reifen Erythrozyten, nämlich Zellen, dass Hämoglobinopathien funktionell entscheidend für Patienten betroffen sind. Bei Patienten mit verschiedenen Blutgruppen sei daran erinnert, dass Cytofluorometric Analyse Chimärismus in roten Blutkörperchen identifizieren durch den Einsatz von monoklonalen Antikörpern auf die Erythrozyten Antigene ABO und C, c, D, E und e10 gerichtet ist , 11. ein anders, aber sehr interessantes Mittel zur Bewertung der Chimärismus in der erythroiden Abstammung ist die Kombination von Flow durchflusszytometrischen Sortierung von erythroiden Vorläuferzellen und Auswahl verschiedener erythroiden Vorläuferzellen durch Kultivierung in klonogenen Assays Analyse von STR12gefolgt. Dieser Ansatz ist in der Lage, die relativen Anteile der Spender-gegen-Empfänger-Chimärismus erythroiden Fach zu quantifizieren und kann genutzt werden, in der Strategie, die Knochenmark-Transplantation zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel der aktuellen Studie ist es, dem Publikum eine Kombination aus beiden Ansätzen geben für Spender/Empfänger Chimärismus in erythroiden Vorläuferzellen nach HSCT bei Patienten analysieren für Hämoglobinopathien behandelt: 1.) Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmarkproben gefolgt von Analyse der kurze Tandemwiederholungen und 2.) koloniebildenden Einheit wächst der Knochenmarkzellen, Klassifizierung von Kolonien in verschiedenen Vorläuferzellen gefolgt von An…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von längerer Regenbogen Südtirol unterstützt.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
