本発明者らは、集団ベースアッセイにおいて可溶性化合物に対するCaenorhabditis elegansの選好を自動的に分析することができる行動記録設定およびプロトコルを提示する。この記事では、ビヘイビアチェンバーの構築、ビヘイビアアッセイプロトコル、およびビデオ分析ソフトウェアの使用について説明します。
線虫であるCaenorhabditis elegansの唯一の302ニューロンのコンパクトな神経系は、様々な行動のレパートリーの基礎を成しています。これらの挙動の根底にある神経回路の解剖を容易にするために、頑強で再現性のある行動アッセイの開発が必要である。以前のC.エレガンスの行動研究では、可溶性化合物に対するC.エレガンスの応答を調べるために、「落下試験」、「走化性アッセイ」、および「保持アッセイ」のバリエーションを使用しています。この資料に記載されている方法は、前述の3つのアッセイの補完的な強みを組み合わせることを目指しています。簡潔には、各アッセイプレートの中央にある小さな円を、コントロールおよび実験溶液を交互に配置して4つの四分円に分割する。ワームを添加した後、アッセイプレートを行動チャンバに入れ、顕微鏡カメラがワームの遭遇を治療領域と記録する。次に、自動化されたビデオ分析が各ビデオの嗜好指数(PI)値が生成される。この方法のビデオ取得および自動解析機能は、実験者の関与および関連するエラーを最小限に抑える。さらに、アッセイごとに微量の実験化合物を使用し、行動チャンバのマルチカメラ設定は実験スループットを増加させる。この方法は、遺伝的突然変異体および新規化合物の行動スクリーンを実施するのに特に有用である。しかしながら、この方法は、対照および実験溶液領域が近接しているため、刺激勾配ナビゲーションの研究には適していない。また、少数のワームしか利用できない場合には使用しないでください。この方法は、現在の形態の可溶性化合物に対する応答のみをアッセイするのに適しているが、マルチモーダル感覚相互作用および光発生研究に適合するように容易に改変することができる。この方法は、他の線虫種の化学感覚応答をアッセイするためにも適用することができる。 </p>
飼育動物は、複数の感覚様式からのインプットを統合し、環境をうまく乗り越えるためには適切な行動戦略を選択する必要があります。外部の感覚入力がどのように受け入れられ、行動選択を導くために神経情報に変換されるのかを理解することは、神経生物学の分野における中心的な目標である。遺伝的に扱いやすい線虫C. elegansは、感覚生物学およびマルチモーダル統合の基礎となる神経メカニズムを研究する魅力的なモデル生物である。 C.エレガンスは、唯一302ニューロンを有しているが、これは検出および可溶性化合物、揮発性臭気物質、周囲温度1、2、3、4、5、6、7を含む環境刺激の多種多様を区別することができます。ザ線虫C. elegansは、食物源を特定し、潜在的な脅威に気づくために、その化学感覚装置に大きく依存する。したがって、野生型および変異体C.エレガンスの化学刺激に対する応答をスクリーニングするように設計された行動アッセイは、 C.エレガンスの顕著な感覚能力の基礎となる遺伝的、細胞性および神経系の解剖において重要な役割を果たす。
可溶性化合物に対する応答をアッセイするために、液滴試験、走化性アッセイ、および保持アッセイの3つのタイプのアッセイが記載されている。落下試験では、化合物の小滴を動くワームの尾に置き、液体が前の知覚装置に到達したら前進または後退するというワームの決定が得られます4 。落下試験はほとんど実験的な準備を必要とせず、レーザー作動ワームの場合のように、ワームのサンプルサイズが小さい場合に有用である。しかし、1つのワーム一度にアッセイすることができ、実験期間中、実験者が存在しなければならない場合、落下試験には時間がかかることがある。ドロップテストは、サンプル内の各ワーム間のドロップデリバリーの変動にも脆弱であり、これはアッセイの全体的な結果に影響する可能性があります。落下試験のもう一つの制限は、ワームの前方への移動からの魅力的または中立的な効果を区別することが不可能であるため、嫌悪化合物に対するワームの反応をアッセイするためにしか使用できないことである。
可溶性化合物のための走化性アッセイは、一般に、2つの対向する象限の寒天および他の2つの象限8,9に混入対照溶液に混合実験溶液で、4つの象限に寒天プレートを分割することを含みます。アッセイの開始時に、ワームを含む緩衝液の一滴をプレートの中央に置き、ワームの数を各象限は、異なる時点で採点される。走化性アッセイは、各アッセイにおいて多数のワームが試験されるため、落下試験と比較してより大きな統計力を提供する。しかしながら、この方法の1つの限界は、走化性アッセイプレートの調製が大量の実験化合物を必要とすることである。これは、アスカロシドシグナル伝達分子10の場合のように、興味のある化合物を得るために収率が限られた複雑な精製プロセスが必要な場合、大規模な挙動スクリーンを行うことを困難にする。さらに、アッセイ中のワームの手動カウントはエラーの影響を受けやすく、カウントプロセス中のプレートの摂動が結果に影響を与える可能性があります。
前述の2つの方法とは異なり、保持アッセイは、スコアリングプロセス中の誤差を最小にし、アッセイ中の実験者の干渉を減少させる機械視覚を利用する > 11。ワームの行動のビデオ記録のコンピュータ化された分析はまた、スコアリングがいくつかの離散的な時点でのみ行われるときに失われる微妙な行動の力学を潜在的に明らかにする可能性がある。保持アッセイでは、2つの溶液スポットが小さな円形の細菌性食品パッチの反対側に加えられ、続いて少数のワームが食品パッチの中央に配置される。次に、ワームの挙動が記録され、分析され、各解決領域内のワームピクセルの総数に基づいて嗜好指標値が計算される。魅力的な食品パッチが存在すると、各アッセイで使用されるワームの個体数がより少なくなる可能性がありますが、食べ物は以前は可溶性忌避剤12への回避行動を感作することが示されていました12 。さらに、ワームは、短波長の光に対して光敏感応答を示し、挙動記録設定において白色光を放射する顕微鏡光源の使用は、挙動に影響を及ぼす可能性があるs = "xref"> 13。
この記事で論じる方法の目的は、集団ベースのアッセイを用いた可溶性化合物のC.エレガンスの選好を記録および分析することである。このために、現在の方法は、前述の3つの方法すべてからの態様を統合し、改善する。これは、ワームの大集団を検査することを可能にし、各アッセイで使用される実験溶液の少量のみを必要とする。さらに、アッセイは赤外LEDバックライトを備えた特注の密閉型動作チャンバー内で行われ、短波長光の影響を最小限に抑えます。各チャンバには、複数の顕微鏡カメラを装備することもでき、ベンチスペースを損なうことなく実験のスループットを向上させます。最後に、ビデオ分析ソフトウェアは、各ビデオの嗜好指数値および付随するワーム占有率プロットを出力して、時間の経過とともに人口行動のダイナミクスを視覚化する。チャンバーのセットアップとassayプロトコルは、臭気物質または化学感覚挙動の温度の影響などの多峰性挙動応答を研究するためにさらに修飾することができる。
この記事では、行動チャンバの構築とアッセイプロトコルについて説明します。また、野生型ワームおよび化学感覚欠損突然変異体の既知の可溶性忌避物質銅イオンに対する反応をアッセイする際のこの方法の有用性も実証している4 。最後に、提供されたソフトウェアを使用したビデオ解析プロセスについて詳しく説明します。
このプロトコルの重要なステップは、アッセイプレートが異なる実験日間にわたって一貫したレベルの乾燥度を有することを保証することである。乾燥レベルが異なると、溶液の寒天への拡散速度が異なり、結果として行動結果が変化する。したがって、アッセイプレートは実験前に常に午後に新鮮にしなければならない。アッセイ間の比較を容易にするために、アッセイごとに試験したワームの数もまた規制しなければならない。上記ウォーム同期プロトコルは17に従っている場合、参照のために、野生型のワームは、アッセイ当たりの平均得> 360のワームに4-10個の卵/時間を産みます。特定の突然変異系統が産卵欠損である場合、産卵のためにより多くの妊娠した成虫の虫を拾い、子孫の標的数に達するようにする。このプロトコルのもう一つの重要なステップは、洗浄プロセスとワームの配置中にワームを静かに処理することです。ワームは機械的刺激に敏感で、ストレス反応を誘発する逆転と産卵阻害18 。さらに、ROIを正確に定義し、ビデオ解析を進める前に、特定の照明条件に対する最適な閾値設定定数を決定するように注意する必要があります。また、最後の実験が実行されてから長い時間が経過した場合には、較正としきい値処理のプロセスを繰り返すことをお勧めします。
この方法の限界は、小さなワーム集団をアッセイするのには適していないということである。しかし、食べ物の存在が感覚行動に及ぼす影響を決定するための適切なコントロールが行われた場合、食物を利用して保持アッセイと同様にワームの空間的探索位置を制限することも可能である。加えて、この方法は、接近しているために刺激勾配ナビゲーションを研究するためのものではなく、少量の対照溶液および実験的溶液滴を使用した。
マルチワームトラッキングとシングルワーム特徴抽出を可能にし、将来においてe_content ">、プログラミングソフトウェアは、このシステム19、20に組み込むことができる。そのような逆転速度と提供する本体屈曲部の振幅のような単一のワームの動作の微妙な挙動パラメータを記録します適切なゲージサイズのシリンジ針を使用してROIを穴を開けることによって慣らしを研究し、穴を寒天注入して慣らしを調べることによって、習慣を研究するためにアッセイを改変することもできるこの方法の別の潜在的な応用は、異なる線虫種に亘って比較行動研究を行うことである。さらに、行動チャンバマルチモーダル刺激に対する行動反応を研究するために複数の方法で修正することができる。オプトジェネティックアプリケーションでは、アッセイ中に目的のニューロンを選択的に活性化するために、高輝度LEDアレイをカメラマウントの隣に取り付けることができます。加熱素子、冷却システム、および温度センサを設定に追加して、感温性の挙動に対する温度の影響を調べることもできます。さらに、臭気送達システムを室内に設置して、臭気感受性モダリティと化学感覚様式との間の相互作用を調べることができる。The authors have nothing to disclose.
いくつかの株は、NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)の資金提供を受けているCaenorhabditis Genetics Center(CGC)によって提供された。この作業は、PWSが調査者であるHoward Hughes Medical Instituteによってサポートされています。
Aluminum T-slotted framing extrusions | McMaster-Carr | 47065T101 | Single profile, 1" size, solid |
Brackets | McMaster-Carr | 47065T236 | 1" long for 1" high single profile extrusions |
Compact end-feed fasteners | McMaster-Carr | 47065T139 | 1" (single), pack of 4 |
Twist-in solid panel holders | McMaster-Carr | 47065T251 | For 1" high extrusion |
Plastic end caps | McMaster-Carr | 47065T91 | For 1" high extrusion |
Optically clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K211 | 3/16" thick, 12" x 12" |
Vinyl-coated polyester fabric | McMaster-Carr | 88505K57 | 0.027" thick, 61" width, black |
Brass grommets | McMaster-Carr | 9604K22 | Trade size 0, 0.545" outer diameter |
Steel washers | McMaster-Carr | 90107A029 | 1/4" screw size |
Rounded head screws | McMaster-Carr | 90272A546 | 1/4"-20 thread size, 1-1/2" long |
Standard operating backlight | Smart Vision Lights | See local vendor | 8"x8", infrared 850nm |
IVP-C1 Variable Control Pot | Smart Vision Lights | See local vendor | |
T1 Power Supply | Smart Vision Lights | See local vendor | |
Dino lite Pro AM4113T | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor | |
MS09B microscope stand | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor |