A<em> Caenorhabditis elegans</em>栄養状態ベースの銅回避アッセイ
Summary
ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。
Abstract
生き残りを確実にするために、生物は、不安定な生息地を避け、一貫した食物源を確保することができなければならない。 Caenorhabditis elegansは、多様な環境刺激の検出時に彼らの歩行パターンを変更し、飢餓状態に応じて行動反応のスイートを調整することができます。線虫は、典型的には、食物源から30分を超えて除去されると、嫌悪反応が減少する。変化する栄養状態に応答する行動変化の観察は、十分に栄養を与えられた状態から飢餓状態への移行を調節する機構に洞察を与えることができる。
本発明者らは、嫌悪な障壁（ すなわち、銅）を横切って長時間にわたり食物源に到達する線虫の能力を測定するアッセイを開発した。このプロトコルは、以前の研究を基にしています。有機体がますます飢えている状態。さらに、このアッセイは、より大きい線虫の集団を同時に評価することができるように、増加したサンプルサイズを可能にする。
銅を検出または応答する能力に欠陥がある生物は、化学バリアを直ちに横切り、一方、野生型線虫は最初に忌避される。野生型ワームはますます飢えているので、障壁を越えて食物源に到達し始めます。我々は、食品感覚または嫌悪な化学物質の検出を含む、多様な環境的合図に応答することができない変異体を評価するためにこのアッセイを設計した。このプロトコルで評価したところ、欠陥のある生物はすぐに障壁を越えたが、食物源を検出することもできなかった。したがって、これらの突然変異体は一時的に食物源に達するにもかかわらず、化学的バリアを繰り返し交差する。このアッセイは、嫌悪と飢餓に関連する可能性のある経路の欠陥を評価するために、ワームの集団を直接的に試験することができる。
Introduction
Caenorhabditis elegansは、わずか302個のニューロンのみからなる神経系の回路分析の比較的容易さのために、数十年間の神経生物学の研究のモデルとして用いられてきた1 。有機体が環境の合図に反応することに頼っているならば、神経系の多くは環境信号の統合を規制することに専念している2 。その神経系の単純さにもかかわらず、 C.エレガンスは、忌避剤3 、誘引物質4 、温度5 、さらには湿度6を含む多様な環境シグナルを検出し、応答することができる。適切に環境シグナルを統合するための失敗は、哺乳動物モデル系の7- 9における行動障害および神経変性条件の数にリンクされています。様々な利用可能な神経疾患モデル C. elegansの 10 株および線虫医薬スクリーン11の開発により、この生物は神経生物学の研究に有用なシステムであることが証明されています。ほぼすべての線虫ゲノム12中の遺伝子、線虫の神経系の我々の理解、ひいては私たち自身にマッピングされた線虫のコネクトーム1および変異の利用可能性を考えると、部分的に創造適切なアッセイの設計によって制限されています。
走化性アッセイの数は、多様な嫌悪刺激3、4、13、14、15に線虫応答性を評価するために、過去40年にわたって開発されてきました。最初の実験では、急速な環境刺激の導入が関与していたが、単一のワームが寒天プレート= "XREF"> 3、14、16。歩行応答に対する即時の変化が記録された。例えば、揮発性臭気物質オクタノールは、毛髪に適用され、野生型ワーム17における後方移動の開始を刺激するために、線虫の鼻の前で漂流され得る。行動選択の評価手段として複数の変数を組み込むために、より複雑なアッセイも開発されている18 。このアッセイのバリエーションには、銅溶液を使用して嫌気性中線バリアを作成することが必要です4 。誘引物質、すなわちジアセチルは、ジアセチル源から離れて移動した虫の化学的障壁の一方の側に置かれた。銅の嫌悪反応に欠陥のあるワームは直ちに障壁を越えてジアセチルに達し、野生型ワームは最初に障壁によって反発した。ワームが最初に銅の障壁に近づいたときの応答が採点された長期間の観察なしに。
ワームが飢餓状態を経て評価されると、環境刺激に対する感受性は低下する19 。忌み嫌う化学オクタノールが線虫の鼻の前で漂流されると、野生型生物は食べ物の上に3〜5秒以内に後退運動を刺激する。これらの生物は10分間食品から除去された後、8〜10秒の遅れた応答を示す20 。したがって、飢餓が増加すると、食物の探索が生存にとってより重要になるので、線虫は有害な環境シグナルに対する嫌悪反応を減少させる。逆に、その過剰発現神経ペプチド受容体9（NPR-9）線虫、食品オンまたはオフオクタノールに応答し、嫌悪刺激21の数に対応することができないことを示しません。これらのnpr-9（GF）生物はまた、食物の存在下でそれらの逆転頻度を調節しないが、過酷なタッチ刺激に反応して逆方向に動き、後方への移動21が可能であることを示す。我々はまた、彼らはまだ食べ物オフ異常な低下反転周波数を示すことが与えられたNPR-9（LF）の変異体は、食品21の存在下で、彼らの行動を調節することができる評価しました。急性外部刺激の導入により、ワームの栄養状態を結合することは食品関連の経路が広く感覚シグナル伝達が22、23の経路を調節することができますするメカニズムの解明に支援しています。線虫環境における食物の存在はまた、エタノール離脱反応を評価するために使用されている24 。この実験では、ワームを様々な濃度のエタノール中でインキュベートし、次いで「飼料競合アッセイ」として知られている寒天プレート上に置いた。食物パッチをプレートの一端に置き、線虫をw食品源から離れて置かれている。エタノール離脱は、ワームが食物のパッチに到達するのに必要な時間を測定することによって評価した。
この栄養ベースの銅回避アッセイは、時間経過に伴う行動変化を評価しながら、追加の環境変数、すなわち食物および銅を統合するための食品競争アッセイに基づいている。これはC. elegansコミュニティー全体で一般的に使用されるプロトコルの適応です4 。このプロトコールは、嫌悪反応および4時間にわたる食物の検出を評価するために使用されている21 。ワームの展示飢餓行動ので、絶食25の30分後、我々はまた、栄養状態への変更は、環境対応に影響を与えることができるかを評価することができます。このアッセイの条件は、実験生物が時間の経過とともに嫌悪感の刺激に反応する反応をどのように変化させるかを測定するため、行動変化を生物は飢えた状態に向かって進行する（そして継続的な飢餓の継続的な測定）。 npr-9（GF）動物は、食べ物や多くの嫌悪的な手がかりに反応して行動を変えないので、これらの行動障害が飢餓の状況で持続するかどうかを特定しようとした。最終的に、このアッセイ設計は、 npr-9（GF）突然変異体を特異的に評価するように処方されているが、新規な菌株を特徴付けるためにさらに適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このアッセイ設計は、食品レースアッセイ24を変更して、嫌気性正中線バリアを作成し、線虫の損失を防ぐためにプレートの縁の周りに銅溶液を含むようにする。生物は、嫌悪の障壁を横切り、4時間にわたって食物パッチに達する能力について試験される。 npr-9（GF）との関連で 、我々は飢餓状態が嫌悪反応および食物の検出にどのように影響するかを評価するため?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、自然科学およびエンジニアリング研究協議会（Canada Discovery Grant）RGPIN36481-08によってWilliam G. Bendenaに支持された。
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
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